大鼠Fcε3－4基因克隆及原核表达

张艳芬，时海浪，王培莹，乔晓强，刘中成

（1．河北大学 实验室管理办公室，河北 保定 071002；2．河北大学 药学院，河北 保定 071002）

大鼠Fcε3－4基因克隆及原核表达

张艳芬1，时海浪2，王培莹2，乔晓强2，刘中成2

（1．河北大学 实验室管理办公室，河北 保定 071002；2．河北大学 药学院，河北 保定 071002）

为了获得重组Fcε3－4蛋白，从变态反应性哮喘大鼠脾组织中提取总RNA，通过RT－PCR方法克隆大鼠Fcε3－4基因，构建成原核表达载体p ET17b－Fcε3－4，并转化大肠杆菌进行诱导表达，Fcε3－4蛋白主要以包涵体形式存在．经Ni－NAT亲和层析柱对尿素溶解的Fcε3－4蛋白进行了纯化，并利用降低尿素梯度的方法柱上对纯化蛋白进行了复性．经Western Blotting和ELISA鉴定，Fcε3－4蛋白具有Fcε的免疫特异性，能被抗大鼠Fcε抗体特异性识别，为下一步研究该蛋白奠定了基础．

大鼠；Fcε3－4基因；克隆；表达；免疫特异性

变态反应性疾病发病机制至今仍不太清楚，目前尚没有肯定的治愈方法，其发病率呈逐年增加的趋势，已成为全球性的社会卫生问题．免疫球蛋白E在变态反应性疾病发病机制中具有重要作用，以IgE／FcεRI信号通路为靶点设计药物，已经成为治疗变态反应性疾病药物开发的一个新靶点和研究热点［1－2］．

Ig E恒定区由4个部分组成，其中Ig E－Fc的Cε2区域对于IgE与其受体FcεRI的结合没有明显的影响．Fcε3－4（Cε3－Cε4）区是与FcεRI作用的关键区域，其作用模式等同于IgE与其受体FcεRI的作用模式［3］．为进一步研究及应用Ig E Fc区，本研究运用RT－PCR技术克隆出大鼠Fcε3－4基因，成功构建重组质粒p ET17b－Fcε3－4，并在大肠杆菌中进行了表达．利用镍柱亲和层析一步法柱上纯化、复性了Fcε3－4蛋白，为进一步研究Fcε3－4蛋白奠定了基础．

1 材料与方法

1．1 主要材料和试剂

大肠杆菌E．coliBL21，质粒p ET17b均由本实验室保存；DNA聚合酶、T4连接酶、限制性内切酶、DNA Marker等分子生物学试剂购自TakaRa公司；PCR产物纯化试剂盒、质粒小量快速提取试剂盒、蛋白质Marker、引物等购自上海生工公司；Ni－NTA柱购自Bio Basic公司；绵羊抗大鼠IgE多抗购自Serotec公司；兔抗绵羊IgG购自北京中杉金桥公司；其他试剂均为国产分析纯．

1．2Fcε3－4基因克隆

卵蛋白（OVA）免疫激发法制备大鼠哮喘模型，取脾脏液氮冻存，参照文献方法RT－PCR扩增Fcε3－4基因［4］．根据所选用载体pET17b序列特征设计引物，上游引物：5’－GGGAATTCCATATGGATGATGAGCCCCGGGGTG－3’，下游引物：5’－CGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGTCATGGAGGC－3’，划线处序列分别为NdeI，Eco RI酶切位点，斜体序列为His标签．引物由上海生工公司合成．

1．3 原核表达载体的构建及鉴定

用限制性内切酶Nde I和Eco R I对质粒p ET17b和PCR回收产物进行双酶切，连接转化大肠杆菌．随机挑取单菌落提取质粒DNA，PCR和双酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测后，选阳性重组质粒送上海生工公司测序．

1．4 Fcε3－4蛋白诱导表达

挑取含有测序正确质粒的单菌落至含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，将菌液按1∶100体积比接入新鲜含氨苄青霉素培养基，37℃振荡培养至OD600达0．6～0．8，加入IPTG至终浓度为1 mmol／L，37℃振荡培养4．5 h，诱导目的蛋白表达．离心收集菌液，并用PBS重悬菌体，超声破碎后，收集上清液和沉淀，进行SDS－PAGE观察表达结果．设空载体作阴性对照．

1．5 Fcε3－4蛋白纯化及柱上层析复性

用含2 mol／L尿素、体积分数1%的Triton X－100的PBS缓冲液洗涤超声破菌后的沉淀，将洗涤后沉淀溶解于含8 mol／L尿素的PBS缓冲液，注入Ni－NAT亲和层析柱．复性前所用平衡缓冲液为50 mmol／L p H7．4的磷酸缓冲液（0．5 mol／L NaCl，8 mol／L尿素，20 mmol／L咪唑）和0．5 mol／L p H 5．0的醋酸缓冲液．然后分别用含6．0，4．0，2．0 mol／L的尿素复性缓冲液（0．5 mmol／L GSSG，5 mmol／L GSH，体积分数10%的甘油，500 mmol／L NaCl，20 mmol／L Tris－HCl，20 mmol／L咪唑，p H8．0）进行梯度洗涤，逐步去除尿素．然后用50 mmol／L咪唑洗脱复性后的目的蛋白．PBS透析目的蛋白，经SDS－PAGE进行分析．

1．6 Western Blotting及间接ELISA分析Fcε3－4特异性

Fcε3－4蛋白经SDS－PAGE后，电转至PVDF膜上．用质量分数5．0%的BSA封闭2．5 h，绵羊抗大鼠Ig E多抗4℃过夜孵育，用HRP标记的兔抗绵羊IgG二抗室温孵育1 h，每次处理前均用TBST洗膜3次．ECL试剂曝光显影定影分析．

将Fcε3－4蛋白梯度稀释（0，5，10，20，40，80μg／m L）后包被96孔板．依次加入绵羊抗大鼠Ig E多抗和HRP标记的兔抗绵羊Ig G二抗，用OPD显色，于波长492 nm用酶标仪测定每孔的光吸收值，同时以PBS为阴性对照．

2 结果

2．1Fcε3－4基因克隆

提取大鼠脾脏总RNA，OD260／OD280为1．95，RNA带型清晰，符合实验要求（图1）．利用所设计的特异性引物扩增目的基因后，经琼脂糖凝胶电泳可见特异性目的条带，其大小同理论值相一致（图2）．

图1 大鼠脾组织总RNA琼脂糖凝胶电泳结果Fig．1 Agarose gel electrophoresis analysis total RNA from rat spleen

图2Fcε3－4基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果Fig．2 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR product ofFcε3－4 gene

2．2 重组表达质粒pET17b－Fcε3－4鉴定

重组质粒p ET17b－Fcε3－4经Nde I和EcoR I双酶切，可产生702 bp大小片段（图3）．测定序列与理论序列相一致，表明重组表达载体p ET17b－Fcε3－4构建成功．

图3 重组表达载体p ET17b－Fcε3－4的双酶切鉴定Fig．3 Restriction enzyme digestion analysis of recombinant expression vector pET17b－Fcε3－4

2．3Fcε3－4基因的表达

挑阳性菌落培养并诱导表达，菌体经超声破碎后，SDS－PAGE结果显示（图4），在破碎后沉淀中29 ku附近有1条过量表达蛋白带，与目的蛋白的预期值相符．空载体对照组全菌、破碎后上清液及沉淀中质粒诱导均未发现目的蛋白表达，表明Fcε3－4基因在宿主细胞中得到表达且表达产物主要以包涵体形式存在．

图4 表达的Fcε3－4蛋白SDS－PAGE分析Fig．4 SDS－PAGE analysis of expressed Fcε3－4 protein

2．4 Fcε3－4蛋白纯化

Fcε3－4蛋白包涵体经洗涤、溶解，Ni－NAT复性纯化后经SDS－PAGE分析显示（图5），包涵体经8 mol／L尿素溶解后与镍柱结合，经低浓度尿素逐级洗脱可去除大量杂蛋白．50 mmol／L咪唑洗脱液洗脱下大部分目的蛋白，200 nmol／L咪唑洗脱液将目的蛋白全部洗脱．

图5 重组蛋白亲和层析纯化SDS－PAGE分析Fig．5 Purification of Fcε3－4 on Ni－NTA agarose affinity column by SDS－PAGE analysis

2．5 Western Blotting鉴定

纯化、复性、透析后的Fcε3－4蛋白经Western Blotting分析显示，在约29 ku处检测到阳性信号，表明纯化后的融合蛋白能够被羊抗鼠Ig E抗体识别，阴性对照中未见阳性信号（图6）；间接ELISA检测显示，Fcε3－4蛋白可被羊抗鼠Ig E抗体所识别，并表现出了浓度依赖性（图7）．

图6 重组蛋白Fcε3－4的Western Blotting分析Fig．6 Western Blotting profile of purified recombinant Fcε3－4 protein

3 讨论

图7 重组蛋白Fcε3－4间接ELISA分析Fig．7 Indirect ELISA analysis of recombinant Fcε3－4 protein

自1966年日本学者Ishizaka发现IgE以来，IgE与其受体FcεRI信号通路一直是变态反应疾病药物研究的热点，并且随着2003年FDA批准人源化抗IgE抗体m Ab E25上市，以IgE为靶点开发药物的可行性得到了证实［5］．IgE重链由4个恒定区组成（Cε1－Cε4），其中Cε3位点是与受体直接结合的部位，Cε2和Cε4位点不与FcεRI直接作用，可能在稳定Ig E－FcεRI复合体及阻止Ig E从其受体上解离方面起一定作用［6］．研究显示，Fcε3－4（Cε3－Cε4）区与FcεRI作用模式和Ig E与其受体FcεRI的作用模式相一致［3］．另文献报道，Ig E与其受体结合时种属特异性较强，人Ig E分子与鼠Ig E受体不能结合，鼠Ig E分子却可与人Ig E受体相结合［7－8］，因此，为了方便利用动物及细胞模型研究Fcε3－4功能，本实验克隆并在原核系统中表达了大鼠Fcε3－4基因．由于Ig E在正常个体中表达量极低，本课题组参照相关文献，通过先制备哮喘大鼠，使大鼠处于致敏状态，以提高Ig E基因表达丰度，通过常规RT－PCR方法顺利克隆了Fcε3－4基因．

Ig E的Fc区体外表达已有大量研究，但此蛋白疏水性较强，原核表达中大多以包涵体形式存在，复性较为困难．本文比较了不同的复性方法，发现用常规稀释法和尿素浓度梯度透析法均不能复性Fcε3－4蛋白，只有层析复性法获得可溶性的Fcε3－4蛋白，并且恢复了Fcε3－4蛋白的免疫特异性，与赵晓瑜等［9］原核表达蚯蚓抗菌肽的结果相一致．原因可能是利用变性蛋白与层析介质的相互作用而抑制蛋白质聚集，每个蛋白分子是相对独立的，易于正确折叠［10－11］．层析复性克服了透析复性容易出现蛋白聚集导致复性失败的缺点，同时避免了稀释复性后体积过大，浓缩困难的弊端［12］．经Western Blotting和ELISA检测表明，所获Fcε3－4蛋白已暴露出其抗原表位，可被抗Ig E抗体所识别，为进一步研究该蛋白奠定基础．

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（责任编辑：赵藏赏）

Cloning and prokaryotic expression of ratFcε3－4 gene

ZHANG Yan－fen1，SHI Hai－lang2，WANG Pei－ying2，QIAO Xiao－qiang2，LIU Zhong－cheng2
（1．Laboratory Management Office，Hebei University，Baoding 071002，China；
2．College of Pharmaceutical Science，Hebei University，Baoding 071002，China）

In order to obtain recombinant Fcε3－4 protein theFcε3－4 gene was amplified by the method of RT－PCR from the total RNA extracted from a fresh spleen of allergic asthma rat，then cloned into expression vector p ET－17b．The Fcε3－4 protein was expressed as inclusion body inE．coliBL21．The denatured Fcε3－4 protein was dissolved in 8 mol／L urea，then purified and refolded in lower urea gradient method on Ni－NAT column．The expressed Fcε3－4 owned the epitope recognised by anti－Fcεantibody through Western Blotting and ELISA analysis，which would be a basis for further studies of the Fcε3－4 protein．

rat；Fcε3－4 gene；clone；expression；immunologic specificity

Q78

A

1000－1565（2012）04－0387－06

2011－12－26

河北省自然科学基金资助项目（C2010000248）；河北省科学技术研究与发展计划项目（11275530）；河北大学大学生科技创新项目（2011089）

张艳芬（1979－），女，河北邯郸人，河北大学讲师，主要从事分子微生物学研究．

刘中成（1979－），男，河北抚宁人，河北大学副教授，主要从事分子药理学研究．E－mail：liuzc＠hbu．edu．cn