顺铂与氯霉素联用增强对人肺腺癌A549细胞的抑制作用

钱海洪，胡义德

顺铂与氯霉素联用增强对人肺腺癌A549细胞的抑制作用

钱海洪，胡义德

（昆明医科大学第六附属医院肿瘤科，云南玉溪653100）

目的体外观察顺铂和氯霉素对人肺腺癌A549细胞的相互作用。方法采用MTT法，利用中效原理判定联合应用顺铂及氯霉素对人肺腺癌A549细胞的效应。结果顺铂与氯霉素联用可以明显抑制人肺腺癌A549细胞的生长，两药单用和联用时随着药物浓度增加，其效应也增加；两药联用时的中效浓度明显小于两药单独使用时的中效浓度（顺铂减少43.8%，氯霉素减少79.1%）；两药大剂量合用时为拮抗效应（CI＞1），小剂量合用时为协同效应（CI＜1）；并且两药合用时的效应与给药的时间先后次序无关（P＞0.05）。结论顺铂与氯霉素的联用可以明显抑制人肺腺癌A549细胞的生长，两药联用时的中效浓度较单用时明显减小；上述两种药合用时大剂量为拮抗，小剂量为协同；两药合用时的效应与给药的时间先后次序无关。

肺腺癌A549细胞；顺铂；氯霉素；中效原理；合用指数

肿瘤化疗作为全身性治疗的手段，它在治疗中具有手术和放疗不可替代的地位，传统的化疗药物疗效不高，毒副反应较大。为了进一步提高化疗疗效，我们在体外观察用顺铂和氯霉素两种药物单用或合用时对人肺腺癌A549细胞的相互作用，并且采用Chou Talalay联合指数法（即中效原理）[1]判断两种药物相互作用的效果。

资料与方法

一、材料

1．细胞培养：人肺腺癌A549细胞系由中科院上海细胞生物研究所提供。用10%新生牛血清RPMI-1640培养液（内含0.11%青霉素、链霉素）培养细胞，并置37℃、5%CO2培养箱内孵育。

2．药物：注射用顺铂（Cisplatin，CDDP）使用时配制成终浓度为0.333、0.666、1.332、2.664和5.328μmol/L 5种浓度，氯霉素注射液（Chloramphenicol，CAP）使用时配制成终浓度为30.947、61.894、123.788、247.576和495.152μmol/L，5种浓度。

二、方法

1．用MTT法[2]检测药物效应：将处于对数生长期的肺腺癌A549细胞制成1.5×104个细胞/ml的悬液，每孔200μl加入96孔培养板内。实验设各种药物浓度试验组及肿瘤细胞阴性对照组和空白组（每组设3个复孔），将两种单药的5种不同浓度分别加入96孔板内，每孔加药量20μl，两药合用比例为1∶1方案，每孔加药总量仍为20μl（每种单药剂量浓缩1倍，各加10μl）。置37℃、5%CO2培养箱内培养3d，用TECAN自动酶标仪测定OD490值。

2．两药合用时间先后次序依赖关系：实验同时设同时给药组、先加CDDP24h后再加CAP组和先加CAP24h后再加CDDP组。培养3d MTT法测定OD490值。

3．结果判定方法：根据中效方程式fa/fu＝（D/Dm）m，两边取对数得lgfa/fu＝mlgD－mlgDm。设Y＝lgfa/fu，X＝lgD，a＝－mlgDm，b＝m，带入上述方程式中得Y＝bX+a。其中fa为细胞抑制率＝1-实验组平均OD值/对照组平均OD值；fu为细胞生存率＝实验组平均OD值/对照组平均OD值；D为药物浓度；Dm为中效浓度即IC50。再根据lgDm＝－a/b就可以算出两种药物单用及合用时各自的中效浓度Dm。然后可计算出两药合用时在各种效应时的合用指数CI＝D1/Dx1+D2/Dx2+α（D1D2/Dx1Dx2），D1、D2为合用时产生X效应时两药各自浓度，Dx1、Dx2为两药单独使用时各自所需浓度，α＝0为两种相互排斥性药物，α＝1为两种相互非排斥性药物。CI＜1协同，CI=1相加，CI＞1拮抗[3]。

4．统计学处理利用统计学软件SPSS10.0进行单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05具有统计学意义。

结果

一、两药单用及合用时不同浓度的效应两种药单用及合用时随着药物浓度增加其效应也增加，见表1。按中效方程式计算m、Dm及γ，见表2。再计算出两药合用在不同效应时的合用指数CI，进而判断两药在不同效应时各自所需药物浓度之间相互作用是协同、相加还是拮抗。因为CDDP与CAP，2药作用机理不同，α＝0。结果见表3；以效应fa为横坐标，CI为纵坐标作量效曲线，见附图。

二、两药合用时间先后次序依赖关系，见表4。

讨论

顺铂是治疗肺癌中最常用的化疗药物之一，属于细胞周期非特异性药物，主要作用靶点是增殖细胞的DNA，有类似烷化剂双功能基团的作用，可和细胞内的碱基结合，使DNA分子链内和链间交叉键联，从而使DNA失去功能，不能复制；高浓度时也抑制DNA和蛋白质的合成。顺铂除了与核DNA相互作用外，线粒体DNA（mtDNA）也是其重要的作用靶点。顺铂可引起肺腺癌A549细胞凋亡已被证实[4,5]，并且上一阶段试验结果表明经顺铂作用后肺腺癌A549细胞中细胞色素氧化酶亚单位Ⅰ（CoxⅠ）、核糖体12SrRNA基因以及半胱氨酸转运RNA（tRNA-Cys）、天冬酰胺转运RNA（tRNA-Asn）基因表达显著上调，由此推测线粒体氧化磷酸化功能的增强是癌细胞对化疗药物的自然反应过程[6]。氯霉素诱导细胞凋亡的作用机理主要有以下几个方面：①抑制线粒体蛋白质的合成；氯霉素通过与线粒体核糖体的70S亚基相结合而抑制线粒体蛋白质的合成，长时间的蛋白质合成障碍会导致能量的匮乏，线粒体膜稳定性的紊乱，最终引起凋亡[7]；②对线粒体呼吸链的影响，Douglas[8]经实验证明氯霉素可以明显降低复合体IV的水平，而对复合体II/III几乎没有影响，从而抑制线粒体呼吸链的功能；③cyt-c增多，氯霉素可以使cyt-c的合成和释放增加[9]，cyt-c的增加又可以诱导凋亡的发生。

在本实验中，从表1可以看出，顺铂和氯霉素单独应用和联合应用时随着药物浓度增加，其效应也增加；这两种药在体外合用后，它们对肺腺癌A549细胞的抑制作用明显加强，并且联用时的中效浓度比单用时要小得多（见表2）。其中CDDP单用时Dm＝2.897μmol/L，合用时Dm＝1.629μmol/L，合用比单用时减少43.8%；CAP单用时Dm＝724.436μmol/L，合用时Dm＝151.462μmol/L，合用比单用时减少79.1%。这充分说明CDDP与CAP联合用药在体外对肺腺癌A549细胞只需小剂量就达到高效应，同时也使药物不良反应减少。

从两种药物合用时的量效曲线也可以看出，当效应fa＝0.55时（即CDDP＝2.461μmol/L，CAP＝228.72μmol/L），其CI为1，说明两种药在该效应时其相互作用为相加；当fa＞0.55时（即CD-DP＞2.461μmol/L，CAP＞228.72μmol/L），CI＞1，为拮抗作用效应；当fa＜0.55时（即CDDP＜2.461μmol/L，CAP＜228.72μmol/L），CI＜1，为协同作用效应。

表1 两种药物单用及合用时不同浓度（μmol/L）时的效应（fa）

表2 两种药物单用及合用时的m、Dm及γ

表3 两种药物在不同浓度时的合用指数

附图CDDP与CAP合用时的量效曲线

表4 两药合用时用药时间先后次序依赖关系

从表4经单因素方差分析结果为：F＝0.564，P＝0.583＞0.05，并认为同时加药组、先加CDDP组和后加CDDP组，3组间在统计学上无显著差异，也就是两药合用时的效应与给药的时间先后次序无关。

顺铂与氯霉素联合应用时，尤其是在药物浓度较小时，对肺腺癌A549细胞具有协同杀伤作用，说明两药在联合应用时，其抑制肺腺癌A549细胞生长的效果要明显强于单独用药，其作用机制有待于进一步的研究。同时顺铂和氯霉素的联合用药也为肿瘤的临床用药开拓了新的思路，有望能进一步提高化疗疗效和降低化疗药物的毒副作用，但要真正用于临床还需要更多的相关研究。

［1］CHOU TC，TALALAY P.Quantitative analysis ofdose-ef

fect relationship：the combined effects of multiple drugs on enzymeinhibitions[J]．ADV Enzyme Regul，1984, 22：37.

［2］汤为学，骆云鹏，王应雪，等.人实体瘤抗癌药物敏感试验MTT法的建立[J]．重庆医科大学学报，1992，17（21）：103.

［3］张连本，张连阳.肿瘤化学治疗敏感性与抗药性[M].成都：四川科学技术出版社，1994:348.

［4］刘文哲，李金瀚.顺铂诱导A549细胞凋亡的研究[J]．中国肺癌杂志，2002，5（4）：254.

［5］刘文哲，胡义德.人肺腺癌A549/DDP耐药细胞减弱顺铂诱导的细胞凋亡[J]．癌症，2000，19（4）325.

［6］孙恒文，胡义德，钱频等.顺铂诱导肺腺癌A549细胞线粒体基因组及凋亡相关基因的差异表达[J].解放军医学杂志，2004，29（12）：1049-1051.

［7］KROEMER G,ZAMZAMI N,SUSIN S.Mitochondrial control ofapoptosis[J]．ImmunologyToday,1997,18：44-51.

［8］DOUGLAS R.Inhibition of mitochondrial protein synthesis results in increased endothelial cell susceptibility to nitric oxide-induced apoptosis[J]．Biochemistry，2002，99(10)：6643～6648.

［9］SIEMENS T,NICHOLS D,ZITOMER R.Effect of mitochondrial functions on synthesis of yeast cytochrome C[J].Journal ofBacteriology，1980，142：499-507.

The interaction between cisplatin and chloramphenicol on human lung adenocarcinoma cell line A549.

QIAN Hai-hong,HU Yi-de
（Department of Oncology，Sixth Affiliated Hospital，Kunming Medical College，Yuxi,Yunnan 653100，China）

ObjectiveTo observe the interaction between cisplatin and chloramphenicol on human lung adenocarcinoma cell line A549.MethodsThe anticancer effect of the drugs was detected with MTT.The median-effect principle was used.ResultsThe combination of cisplatin and chloramphenicol significantly inhibited the growth of human lung adenocarcinoma cell line A549.Anticancer effects of the individual and combined drugs enhanced as drug concentration increased.The 50%inhibited concentration of each drugs in combination was lesser than the concentration of each individual drugs.(Cisplatin decreased of 43.8%,Chloramphenicol decreased of 79.1%).The combination of the two drugs at higher concentration the CI was more than 1,and the combinations at lower concentration the CI was less than 1.The sequence of administration did not influence the anticancer effects (P＞0.05).ConclusionThe combination of cisplatin and chloramphenicol significantly inhibited the growth of human lung adenocarcinoma cell line A549.The 50%inhibited concentration of each drugs in combination was lesser than the concentration of each individual drugs.The combined drugs interaction was antagonistic at higher concentration and synergistic at lower concentration.The sequence ofadministration did not influence the anticancer effects.

Lung adenocarcinoma cell line A549；Cisplatin；Chloramphenicol；Median-effect principle；Combination index

R734.2

A

1006-4141（2012）04-0346-04

2012－04－10

钱海洪（1974～）男，主治医师，硕士生，主要从事肿瘤细胞线粒体功能干预对其化疗敏感性进行调控的研究工作。

胡义德，男，主任医师，博士后，教授，硕士生导师。