叶酸和维生素B12减轻高同型半胱氨酸血症诱导的老年大鼠阿尔茨海默样病变*

魏 伟， 陆大祥， 戚仁斌， 王达安

(暨南大学医学院病理生理教研室，国家中医药管理局病理生理学三级科研实验室，广东 广州 510632)

1000-4718(2012)08-1436-05

2012-05-07

2012-06-19

国家自然科学基金资助项目 (No.81100944)；广东省医学科研基金资助项目(No.B2011156)；暨南大学博士启动基金资助项目(No.21611334)

△通讯作者 Tel: 020-85220253; E-mail: rocky1240@163.com

叶酸和维生素B12减轻高同型半胱氨酸血症诱导的老年大鼠阿尔茨海默样病变*

魏 伟△， 陆大祥， 戚仁斌， 王达安

(暨南大学医学院病理生理教研室，国家中医药管理局病理生理学三级科研实验室，广东 广州 510632)

目的探讨慢性高同型半胱氨酸血症对老年大鼠脑内 tau 蛋白结构和功能的影响以及其可能机制。方法选取18月龄健康大鼠，尾静脉注射同型半胱氨酸(Hcy)生理盐水溶液(1.6 mg·kg-1·d-1)制造高同型半胱氨酸血症模型组，在给予 Hcy 的同时通过饮用水给予叶酸(4 mg·kg-1·d-1) 和维生素B12(Vit B12,250 g·kg-1·d-1)作为治疗组，单纯注射生理盐水作为对照组，持续28周，Bielschowsky 银染观察磷酸化 tau 蛋白的分布和聚集；Western blotting 检测磷酸化 tau蛋白、糖原合酶激酶3β (GSK-3β)和蛋白磷酸酶2A(PP2A)的表达。结果(1)血浆中 Hcy 水平增高导致神经原纤维样缠结；给予叶酸和Vit B12能够有效减轻缠结；(2)血浆高 Hcy 水平诱导老年大鼠脑内 tau 蛋白在Ser199/202和Ser396位点磷酸化水平升高；(3)血浆高 Hcy 水平激活 GSK-3β 同时抑制 PP2A 的活性。补充叶酸和Vit B12有效地缓解了这些激酶和酯酶的活性改变，并下调了 tau 蛋白 Ser199/202和Ser396位点的磷酸化水平。结论补充叶酸和Vit B12能够有效改善高同型半胱氨酸血症所诱导的 tau 蛋白阿尔茨海默样病理改变，其机制可能与其抑制GSK-3β活性和激活PP2A有关。

老年大鼠； Tau蛋白; 叶酸; 维生素B12; 阿尔茨海默病

阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)的两大病理学特征是神经元内的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)和主要存在于细胞外的老年斑(senile plaques, SPs)[1], 神经原纤维缠结主要由异常过度磷酸化的骨架蛋白 tau 构成，但是诱导 NFTs 形成的上游效应目前还没有完全清楚。同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是体内提供甲基和转硫作用的关键物质，当体内叶酸和维生素B12[folate and vitamin B12(Vit B12), FB]缺乏时，血浆 Hcy 水平增高就成为一碳转移反应所需的辅助因子缺乏的直接结果。众多临床调查表明，血浆 Hcy 水平升高与 AD 的发生呈正相关，因此高 Hcy 血症已被提出作为一个独立的危险因素[2]。Hcy 损坏海马神经元内的受损DNA修复，使神经元更易受淀粉样蛋白毒性损坏[3]。但是高同型半胱氨酸血症对老年大鼠 NFTs 的影响直到现在还没有报道。因此本次研究使用24月龄的大鼠(相当于人的年龄65岁[4])，探讨高同型半胱氨酸血症诱导的老年大鼠脑内的 tau 蛋白病理改变。我们发现高 Hcy 血症可导致tau蛋白结构和功能的改变，其机制包括蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)的活性抑制和糖原合酶激酶3β (glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)被激活。同时补充 FB 可以有效改善高 Hcy 血症诱导的上述阿尔茨海默氏样病变。

材 料 和 方 法

1动物

实验动物为华中科技大学同济医学院动物中心提供的SD大鼠，成年雄性，18月龄，体重(500 ± 20) g，在安静、室温25 ℃左右、昼夜节律12 h∶12 h的环境下饲养。

2主要试剂

DL-Hcy购于Sigma。p-Ser396抗体购于Biosource，用来检测 Ser396位点的磷酸化tau蛋白。Tau1抗体购于Chemicon，用来检测 Ser199/202位点的非磷酸化tau蛋白。Tau5抗体购于NeoMarkers，用来检测 tau蛋白总量。DM1A购于Sigma，用来检测α微管蛋白。PP2A-C、p-PP2A-C-Tyr307、GSK3β和p-GSK-3β-Ser9抗体购于Cell Signaling，分别用来检测PP2A催化亚基C的总量和其Tyr307位点的磷酸化，GSK3β的总量和其Ser9位点磷酸化。叶酸购于Yabang Aipusen，Vit B12购于云鹏有限公司。二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白测定试剂盒、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ⅱ抗和化学发光底物(ECL)试剂盒购自Pierce。

3主要方法

3.1AD 样模型的复制 Hcy 以生理盐水配制，浓度为400 mg/L。叶酸和Vit B12片剂研磨后溶于大鼠饮用水中[5]。为了建立老年大鼠高 Hcy 血症慢性模型，我们对18个月龄的大鼠通过尾静脉注射 Hcy(400 μmol/L，4 mL/kg，每3 d 1次)作为模型组(Hcy,n=20)，同时饮用水补充叶酸(4 mg·kg-1·d-1)和Vit B12的(250 μg·kg-1·d-1)作为治疗组(Hcy+FB,n=20)，生理盐水(NS)注射作为对照组(control,n=20)，注射持续28周。

3.2高压液相色谱法测定 Hcy 的含量[6]高压液相所用的所有试剂均用Barnstead纯水仪所制的超纯水配制并经0.22 μm滤膜过滤。所采集血用肝素抗凝，血样于室温下30 min 内分离，3 000×g离心10 min分离血浆。取血浆105 μL加入2.5 mmol/L乙酰半胱氨酸15 μL和SE液(4.5%NaCl，20 mmol/L EDTA)30 μL，振荡混匀；加入0.6 mol/L 3-丁基磷15 μL混匀，冰浴反应30 min。加入0.6 mol/L高氯酸150 μL混匀，室温放置10 min，5 000×g离心5 min。取上清液25 μL加入0.125 mol/L硼酸缓冲液(pH 9.5)62.5 μL、1.55 mol/L 氢氧化钠5 μL和SBDF 25 μL混匀后，60 ℃孵育60 min，放人冰水中终止反应。反应产物3 000×g离心3 min，取上清液10 μL 进样作高效液相分析。样本 Hcy 和内标的保留时间分别为3.056 min和5.763 min，并能与其它峰有效地分开。血浆 Hcy的标准曲线用加入已知量的Hcy到正常血浆中，通过上述反应来测定，由加入的 Hcy 浓度对绝对峰面积作标准曲线，所加入Hcy的变化范围为0～45 μmol/L，在此变化范围内，Hcy浓度与绝对峰面积之间具有良好的线性关系(R2=0.9993，Y=0.007819，X=0.0042)。

3.3Bielschowsky银染[7]大鼠经过灌注、固定后对脑组织进行振荡切片，厚度为30 μm。切片用PBS洗3×5 min，2%～4%AgNO3，37 ℃避光30 min，ddH2O洗3×5 min，10%甲醛还原5 min至切片微黄，ddH2O洗3×5 min，200 μL/片加入氨银乙醇液5 min，ddH2O洗3×5 min，常规脱水、透明、封片。

3.4免疫印迹 取同侧海马加入400 μL匀浆液(100 mmol/L Tris-HCl pH 7.4, 300 mmol/L NaCl, 20 mmol/L NaF, 2 mmol/L Na3VO4·12H2O, 1 mmol/L EDTA, 0.5 mmol/L PMSF， 2.0 mg/L 胃蛋白酶抑制剂)进行匀浆、超声。加入1/3体积的4×上样缓冲液，煮沸 10 min 使蛋白变性, 4 ℃、12 000 r/ min离心15 min，取上清。BCA法测定样品的蛋白含量，各泳道的蛋白上样总量为30 μg。样品经 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至醋酸纤维(NC)膜上，将 NC 膜用5%脱脂奶粉室温振荡封闭60 min，加入I抗, 4 ℃孵育过夜，TBS缓冲液 (Tris 50 mmol/L, NaCl 100 mmol/L，pH 7.5) 冲洗3次。加HRP标记的羊抗兔II抗 IgG (1∶5 000)， 37 ℃孵育膜1 h，TBS漂洗10 min×3次。加ECL显色液显色后进行曝光、冲洗胶片，扫描分析条带后保存胶片。

4统计学处理

结 果

1补充叶酸和VitB12可逆转血浆Hcy水平的升高

使用高效液相色谱法测定各组老年大鼠血浆中Hcy的水平，结果发现，Hcy组血浆内Hcy水平明显升高，达15.2 μmol/L，较control组 8.6 μmol/L明显升高，表明高Hcy血症模型制造成功；与Hcy组相比，Hcy+FB组血浆内Hcy水平明显降低至12.6 μmol/L，显著差异(P<0.05),见表1。这个结果表明，叶酸和Vit B12可有效降低血浆内Hcy水平。此外，各组大鼠的体重没有显著差异。

表1各组大鼠血浆Hcy和体重的变化

GroupHcy(μmol/L)Weight(g)Control8．6±1．1545±15Hcy15．2±1．2∗543±17Hcy+FB12．6±1．1#547±19

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHcy group.

2血浆高Hcy水平可诱导老年大鼠海马tau蛋白神经纤维样缠结

Hcy组在海马CA3区细胞质染色增加，而在补充叶酸和Vit B12后染色弱于Hcy组，见图1。我们还检测了大鼠的脑皮质染色变化，发现染色主要分布在细胞质和突起，在Hcy组胞浆染色更深，更重要的是，该突起是蜿蜒而不是直线，在补充叶酸和Vit B12后细胞质的染色变得非常弱，突起变直。

Figure 1. Bielschowsky silver staining of rat hippocampus and cortex. In the CA3 region of hippocampus, the staining was increased mainly in the cytoplasm after 28-week injection of Hcy, while the staining of the cytoplasm in Hcy+FB group became weaker than that in Hcy group and the neurites was also a little stained. In the cortex of the rat brain, the staining was distributed in the cytoplasm and neurites, but it was more deeply stained in the cytoplasma of Hcy group, and the cytoplasma staining became very weak after FB injection. Scale bar = 100 μm.

图1Bielschowsky银染检测纤维状缠结结构

3血浆高Hcy水平可诱导老年大鼠海马tau蛋白过度磷酸化

Hcy 组p-Ser396表达升高，而非磷酸化的 Tau1表达降低；与Hcy组相比，Hcy+FB组p-Ser396蛋白表达水平明显降低，而Tau1表达水平升高，Tau5(检测总tau水平)没有明显变化，见图2。这提示高Hcy血症可诱导tau蛋白在Ser396和Ser199/202位点磷酸化水平明显增加；补充叶酸和Vit B12可明显逆转由高Hcy所诱导的tau蛋白多位点磷酸化水平的升高。

4Hcy对蛋白激酶和磷酸酶活动的影响

Hcy注射后GSK-3β和PP2A-C蛋白水平没有变化，但GSK-3β在Ser9位点磷酸化(非活性)水平下降，p-PP2A-C-Tyr307(非活性)水平升高，补充叶酸和Vit B12后使上述各指标恢复到正常水平，见图3。这说明高Hcy水平可使GSK-3β活性升高，PP2A活性降低；而补充叶酸和Vit B12后恢复这些活性的变化。

图2叶酸和VitB12对Hcy引起的大鼠海马tau蛋白过度磷酸化的影响

图3叶酸和VitB12对Hcy引起的tau蛋白上游激酶和磷酸酶的影响

讨 论

随着年龄的增加，血浆Hcy的浓度逐渐增加[8]，高Hcy血症已被作为阿尔茨海默氏病的一个强大和独立的危险因素[2]，以上研究结果提示，Hcy血症和阿尔茨海默病的病变之间可能存在一定联系。由于阿尔茨海默病是高发于老年人的疾病，所以在本次研究中我们通过构建高Hcy血症老年大鼠模型，研究高Hcy血症对大鼠微管相关蛋白 tau的作用及其可能机制。tau蛋白是主要的细胞骨架蛋白之一，能够调节神经元的结构和功能，包含85个潜在的磷酸化位点[9]，在老年痴呆中，这些位点按一定的顺序先后发生磷酸化[10]。作为神经缠结的主要蛋白成分之一，与老年痴呆的遗忘症状呈正相关性[11]。高Hcy血症能诱导老年大鼠tau蛋白在多个老年痴呆样位点的过度磷酸化。由于tau蛋白磷酸化会增加tau不溶性而使tau蛋白聚积而形成缠结，我们通过Bielschowsky银染发现了过度磷酸化tau蛋白组成的缠结样结构。

由于在老年痴呆病症中，tau蛋白的过度磷酸化是蛋白激酶和磷酸酯酶不平衡表达的结果，因此，我们检测了参与tau蛋白磷酸化调节的蛋白激酶GSK-3β和磷酸酯酶PP2A。结果发现，PP2A活性降低而GSK-3β活性增加，这说明 PP2A 和 GSK-3β可能参与了高Hcy诱导的tau蛋白过度磷酸化，但详细机制需要作进一步的研究。

Hcy来自必需氨基酸蛋氨酸，可以再甲基化成蛋氨酸。这种反应是由蛋氨酸合成酶催化，这就要求Vit B12作为辅助因子，甲基四氢叶酸作为辅助碳源。通过补充B族Vit减少血浆Hcy的浓度可能会提供一些针对认知功能减退的保护[12]。本次研究结果证实了这点推测。补充叶酸和Vit B12可以降低血浆中Hcy水平，逆转由高Hcy所导致的tau蛋白过度磷酸化。

Hcy血症可能以多种方式促进痴呆症的发病机制，如通过脑微血管内皮功能障碍，氧化应激，β淀粉样肽的神经毒性及神经细胞凋亡。Hcy的代谢产物磺基Hcy，也可能通过激活N-甲基-D-天冬氨酸受体造成神经元兴奋刺激[13]。是否这些机制在老年大鼠大脑中发挥相同的功能还需要进一步研究。

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ProtectiveeffectoffolateandvitaminB12onAlzheimer-likepathologicalchangesinbrainofagedratswithhyperhomocysteinemia

WEI Wei, LU Da-xiang, QI Ren-bin, WANG Da-an

(DepartmentofPathophysiology,KeyLaboratoryofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou, 510632,China.E-mail:rocky1240@163.com)

AIM: To explore the effect of hyperhomocysteinemia on the Alzheimer-like pathological changes in the brain of aged rat.METHODSThe rats were treated with homocysteine (Hcy) by intravenous injection through vena caudalis with or without a simultaneous supplementation of folate and Vitamin B12(FB) in the drinking water for 28 weeks. The distribution and aggregation of tau protein were detected by Bielschowsky silver staining. Western blotting was used to determine the protein levels of tau phosphorylation, glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) and protein phosphatase 2A (PP2A).RESULTSTreatment with Hcy induced hyperhomocysteinemia in aged rats and resulted in the formation of neurofibrillary tangles in the brain. Supplementation of FB effectively reduced the tangles. Hyperhomocysteinemia also induced Alzheimer-like tau hyperphosphorylation at multiple sites (Ser199/202and Ser396). Hyperhomocysteinemia activated GSK-3β and inhibited the activity of PP2A. Supplementation of FB alleviated the changes of tau and the activities of GSK-3β and PP2A.CONCLUSIONSupplementation of FB ameliorates the hyperhomocysteinemia-induced Alzheimer-like pathological changes of tau protein possibly through regulating the activity of GSK-3β and PP2A in aged rats.

Aged rat; Tau protein; Folic acid; Vitamin B12; Alzheimer disease

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.08.018