Ghrelin及GHSR在急性坏死性胰腺炎大鼠胰腺组织的表达

方春芸 唐国都 梁志海 唐曦平

·论著·

Ghrelin及GHSR在急性坏死性胰腺炎大鼠胰腺组织的表达

方春芸 唐国都 梁志海 唐曦平

目的观察急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺组织ghrelin以及生长激素促分泌素受体(GHSR)的表达，探讨ghrelin在ANP发病机制中的作用。方法70只大鼠按完全随机法分为ANP组和对照组，每组35只。采用逆行胆胰管注射4%牛磺胆酸钠的方法制备大鼠ANP模型；对照组仅开腹，轻翻动胰腺。术后3、6、12、24、48 h处死大鼠，取血测血清淀粉酶，取胰腺行常规病理检查并评分，应用RT-PCR和蛋白质印迹法检测胰腺组织ghrelin、GHSR的mRNA及蛋白表达。结果ANP组大鼠血清淀粉酶浓度从造模后3 h开始升高，6 h达(8244±2950)U/L，显著高于对照组(P<0.05)；胰腺病理损伤及评分随时间延长逐渐加重，24 h评分为(11.91±1.31)分，显著高于对照组的(3.12±1.60)分。ANP组大鼠胰腺组织ghrelin mRNA和GHSR mRNA表达随时间的延长而逐渐升高，48 h达峰值，分别为1.29±0.64和0.94±0.16，均显著高于对照组的0.58±0.05和0.19±0.03(P值均<0.05)。ANP组大鼠胰腺组织ghrelin和GHSR蛋白的表达在48 h时达峰值，分别为3.05±0.48和2.34±0.32，均显著高于对照组的2.18±0.23和1.55±0.10(P值均<0.05)。结论ANP大鼠胰腺组织ghrelin、GHSR的mRNA及蛋白表达均显著增加，且与胰腺病变严重程度有关。

胰腺炎，急性坏死性； 受体，内源性物质； 生长激素促分泌物受体； Ghrelin

Ghrelin是一种生长激素促分泌物受体(growth hormone secretagogue recepter，GHSR)的内源性配体。研究表明[1]，ghrelin通过与GHSR作用抑制炎性因子产生。本研究检测急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺组织中ghrelin和GHSR mRNA及蛋白的表达，探讨ghrelin 在ANP发病机制中的作用。

材料与方法

一、实验动物及分组

SD大鼠70只，清洁级，雄性，体重250～300 g,由广西医科大学实验动物中心提供。适应性喂养1周后按完全随机法分为对照组和ANP模型组， 每组35只。采用胆胰管逆行注入4%牛磺胆酸钠(日本TCI公司)1 ml/kg体重的方法制备ANP模型。对照组开腹轻翻动胰腺组织后关腹。术后3、6、 12、 24、48 h分批处死大鼠，采血并分离血清；取胰腺组织，部分10%甲醛固定，部分置-80℃保存。

二、观测指标及检测方法

1．血清淀粉酶检测：由全自动生化分析仪测定。

2．胰腺组织病理学检查及评分：固定的胰腺组织常规脱水、包埋、切片及HE染色，光镜下阅片。参考Schmidt等[2]标准从水肿、出血、坏死及炎症细胞浸润4个方面进行评分。

3．胰腺组织ghrelin mRNA及GHSR mRNA检测：采用RT-PCR法。用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取组织总 RNA。ghrelin引物上游5′-AGCCCAGCAGAGAAAGGAAT-3′，下游5′-AGGGAGCATTGAACCTGATTT-3′，扩增片段137 bp；GHSR引物上游5′-AAGCTGGTCATCCTTGTCATCT-3′，下游5′-TTCACTGTCTGCTTGTGGTTCT-3′，扩增片段305 bp；GAPDH(内参)引物上游5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，下游5′-GTCCACCACCCTGTTGCT-GTAG-3′，扩增片段496 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR扩增条件：95℃ 4 min，95℃ 30 s、 59℃ 30 s、72℃ 30 s，35 个循环，72℃ 7min。PCR 产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离后进行凝胶成像系统分析，以ghrelin/GAPDH和GHSR/GAPDH灰度比值表示mRNA相对表达量。

4．胰腺组织ghrelin及GHSR蛋白检测：采用蛋白质印迹法。称取80 mg冻存胰腺组织标本，剪碎后研磨，用总蛋白提取试剂盒(碧云天公司)提取胰腺组织总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。取50 g样品常规行蛋白质印迹法检测ghrelin及GHSR蛋白。兔抗鼠ghrelin多抗(美国proteintech公司)和兔抗鼠GHSR多抗(abcam公司)1∶600稀释，山羊抗兔二抗(辣根过氧化物酶标记) 1∶2000稀释，最后ECL发光，X胶片曝光。应用图像分析仪扫描，获取条带灰度值。

三、统计学处理

结 果

一、血清淀粉酶的变化

ANP组大鼠血清淀粉酶浓度于造模后3 h明显上升，6 h达峰值，并持续处于高水平状态，较对照组同时点大鼠显著升高(P值均<0.05，表1)。

二、胰腺大体及病理改变

对照组大鼠胰腺大体无明显改变；镜下见胰腺小叶完整，细胞形态正常，无明显出血、坏死，偶有轻度水肿及少量炎细胞浸润。ANP组大鼠胰腺明显水肿，有暗红色出血样及胶冻样坏死改变；镜下见胰腺间质增宽，腺小叶结构破坏，腺泡细胞空泡样变，炎性细胞浸润，局灶或大片出血坏死，病理评分均较同时点对照组明显升高(P值均<0.05，表1)。

三、胰腺组织ghrelin mRNA及GHSR mRNA表达

ANP组大鼠胰腺组织ghrelin mRNA和GHSR mRNA表达均较同时点对照组明显升高(t值分别为4.121、11.334、6.270、15.089、20.090；6.109、17.506、8.143、10.074、6.619。P值均<0.05)，表达量随时间延长而逐渐增加(图1，表2)。

表1 各组大鼠血清淀粉酶水平和胰腺病理评分

注：与对照组比较，aP<0.05

1～5：ANP组3、6、12、24、48 h ；6～10：对照组3、6、12、24、48 h

四、胰腺组织ghrelin及GHSR蛋白表达

ANP组胰腺组织ghrelin和GHSR蛋白表达在12、24、48 h点均较同时点对照组显著升高(t值分别为3.003、2.646、3.706；3.702、5.402、5.288。P值均<0.05，表2，图2)。

图2 两组胰腺组织ghrelin(上)、GHSR(下)表达

自从1999年Kojima等发现ghrelin之后，研究表明它有多种生物学功能，包括刺激生长激素释放、调节摄食、刺激胃酸及胃蛋白酶的分泌、调节血压和心率、调节胰岛素分泌等[3]。此外，ghrelin有抑制炎症反应的作用，可显著降低致炎物质诱导的炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α等的表达及分泌[1]。Kizaki等[4]应用siRNA技术沉默ghrelin基因后，NF-κB的活性及TNF-α基因表达明显增加，提示ghrelin通过负向调控NF-κB的活化来抑制前炎症因子的产生。在急性胰腺炎(AP)研究方面，Kerem等[5]的研究显示，ANP大鼠血清ghrelin水平在造模后24 h明显升高，并于48 h达到高峰，可以作为AP疾病严重程度的观察指标。Warzecha等[6]、Sehirli等[7]采用外源性ghrelin干预ANP大鼠，发现可减轻胰腺及远隔器官的损伤，其机制包括改善脏器的血流灌注、抑制炎症因子产生、促进胰腺细胞增殖等。Zhou等[8]报道，ghrelin可阻断炎症信号通路，抑制核因子NF-κB的表达，减轻ANP并发的肝损伤。Zhang等[9]、Dembinski等[10]报道，ghrelin主要通过影响胰腺外分泌、抗氧化及抑制细胞因子介导的炎症反应而减轻胰腺的损伤。

表2 各组大鼠胰腺ghrelin mRNA及蛋白、GHSR mRNA及蛋白的表达变化

注：与对照组比较，aP<0.05

Ghrelin需要与其功能性受体GHSR-1α结合才能发挥其功能。Delgado等[11]研究表明，ghrelin能抑制自身免疫所产生的T细胞，当细胞被炎性反应激活后，细胞内GHSR出现明显的激活极化现象，并且mRNA表达也明显升高，其机制可能是当炎症发生时，炎性反应所分泌的致炎因子能促进保护性的物质ghrelin的表达和分泌，同时上调其受体GHSR的表达，而ghrelin反过来通过激活受体来抑制这些致炎因子，减轻感染、中毒性休克引起的全身炎症反应综合征(SIRS)。另外，也可能是ghrelin通过抑制氧自由基的产生，激活位于中枢神经系统的ghrelin受体来增加生长激素的释放，提高组织的再生和维持完整性的功能，从而增强胰腺组织损伤时的自然防御能力[12]。

本实验结果显示，ANP大鼠胰腺组织ghrelin mRNA和GHSR mRNA表达水平随时间的延长而逐渐增加，且高于对照组，但ghrelin和GHSR蛋白表达在3、6 h点上与对照组差异无统计学意义，这可能是AP早期未充分应答的原因。随着巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞过度激活，产生瀑布式级联反应，不断产生的炎性因子促进ghrelin及其受体的表达，并随疾病发展呈上升趋势，提示ghrelin及受体在AP时的表达可能与病变严重程度有关。Ghrelin作为一个重要的改善炎症的药物，在AP治疗上具有潜在的临床价值和重要的应用前景。

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Expressionofghrelinandhormonesecretagoguereceptorinpancreasofratswithacutenecrotizingpancreatitis

FANGChun-yun,TANGGuo-du,LIANGZhi-hai,TANGXi-ping.

DepartmentofGastroenterology,FirstAffiliatedHospital,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China

TANGGuo-du,Email:tguodu02@yahoo.com.cn

ObjectiveTo observe the expression of ghrelin and growth hormone secretagogue receptor (GHSR) in pancreas of rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP), and investigate the role of ghrelin in the pathogenesis of ANP.MethodsSeventy SD rats were randomly divided into ANP group (n=35) and control group (n=35). ANP model was induced by retrograde injection of 4% sodium taurocholate into the biliary and pancreatic duct. Rats in the control group underwent laparotomy with gentle pancreas manipulation only. At 3, 6, 12, 24, 48 h after ANP induction, the rats were sacrificed, and the serum level of amylase was determined, pathological changes in pancreatic tissue were routinely observed and scored. The expressions of ghrelin mRNA, protein and GHSR mRNA, protein in pancreas were evaluated by RT-PCR and Western blot.ResultsSerum amylase level began to increase at 3h after sodium taurocholate injection and reached the peak value at 6 h [(8244±2950)U/L], which was significantly higher than that in control group (P<0.05). Pancreatic injuries was aggravated with time, the pathologic score at 24 h was (11.91±1.31) score, which was significantly higher than (3.12±1.60) score in the control group. The expressions of ghrelin mRNA and GHSR mRNA in pancreas of ANP group were increased gradually with time, and were significantly higher than those of control group at all time points, at 48 h, 1.29±0.64vs0.58±0.05 and 0.94±0.16vs0.19±0.03,P<0.05. The expressions of ghrelin protein and GHSR protein in pancreas of ANP group were significantly higher than that in control group at 12, 24, 48 h. at 48 h, 3.05±0.48vs2.18±0.23 and 2.34±0.32vs1.55±0.10(P<0.05).ConclusionsThe expressions of ghrelin mRNA, protein and GHSR mRNA, protein of pancreas are significantly increased in rats of ANP, and are associated with the severity of ANP.

Pancreatitis, acute necrotizing; Receptors, endogenous substances; Growth hormone secretagogue recepter; Ghrelin

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.06.007

国家自然科学基金(81060043)

530021 广西南宁，广西医科大学第一附属医院

唐国都，Email:tguodu02@yahoo.com.cn

2012-07-04)

(本文编辑：屠振兴)