实时荧光PCR法与流式细胞术两种方法检测HLA－B27的比较

陈慧毅，褚为靖，张会英＊，葛艳玲，张 茜

（1.北京积水潭医院 检验科，北京100035；2.卫生部北京医院 检验科）

人类白细胞抗原（HLA）是一组位于人体细胞膜表面能够识别“自己”或“非己”的抗原分子，由位于人类6号染色体短臂上的一组主要组织相容性复合体基因（MCH）编码。这些基因包括很多基因座位，例如：HLA－A，HLA－B，HLA－DR等，每个基因座位包括很多等位基因。其中HLA－B27是HLAB基因座位上的一个重要的等位基因。现在研究表明HLA－B27与强直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis，AS）具有高度的相关性［1］。Brown等［2］报道AS患者中，HLA－B27抗原呈阳性者高达94%，而健康人群仅为9%。因此，HLA－B27检测已经成为临床上支持AS诊断的重要依据。检测HLA－B27的方法有多种，大多数实验室常采用的有：微量细胞毒试验、酶联免疫方法、流式细胞仪检测法、PCR法等。以PCR为基础的多种分子生物学技术被用于检测 HLA－B27基因型，如 PCR－RFLP、PCR－SSP、PCR－SSO和PCR－LBT等，这些方法都需要在PCR后进行凝胶电泳，而且使用强诱变剂EB为染料，不仅费时费力，而且容易造成污染而出现假阳性结果，使这些PCR方法的应用受到一定的限制。实时荧光PCR是20世纪90年代发展起来的新型核酸检测技术，此法将先进的光学设备、温控技术、荧光素标记技术、核酸扩增技术以及计算机软件有机地结合起来，能够对PCR每一循环的荧光强度进行检测，故称为实时荧光PCR。本研究采用实时荧光PCR和流式细胞术检测HLA－B27，比较两种方法的优缺点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源 2010年8月至2011年3月北京积水潭医院门诊或住院患者138例，其中男85例，女53例。对收集到的138例外周静脉血同时采用荧光PCR染料法和流式细胞术检测HLA－B27。

1.2 仪器和试剂

1.2.1 流式细胞仪（EPICS－XL）和样品制备仪（EPICS Immunology Workstation，Coulter Q－prep）购于美国贝克曼库尔特公司。流式细胞仪检测用试剂，异硫氰酸荧光素／藻红蛋白（FITC／PE）标 记 的 HLA－B27／HLA－B7 单 克 隆 抗 体、IgG1－FITC／IgG2a－PE 和 CD4－FITC／CD8－PE 荧 光抗 体购于法国Immunotech公司；荧光校准微球（Flow Check）及样品制备试剂（ImmunoPrep Reagent System）购于美国贝克曼库尔特公司。

1.2.2 PCR扩增仪（Roche LightCycler 480），微型高速离心机（Microfuge 22Rcentrifuge）购于美国贝克曼库尔特公司，恒温金属浴（HB－100）购于杭州博日科技有限公司，血液基因组DNA提取试剂盒购于天根公司，HLA－B27荧光PCR基因检测试剂盒购于博奥生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 流式细胞术检测人类白细胞抗原HLA－B27的步骤

（1）血样采集：空腹抽取静脉血2ml，EDTA－K3（乙二胺四乙酸三钾）抗凝。（2）细胞荧光染色：取3支流式细胞仪专用试管，分别标注对照管、补偿管和患者血样管。对照管加IgG1－FITC／IgG2a－PE荧光抗体10μl，补偿管加CD4－FITC／CD8－PE荧光抗体10μl，患者血样管加 HLA－B27－FITC／HLA－B7－PE荧光抗体10μl。然后分别在3支试管中加入患者EDTA抗凝全血各100μl，轻轻混匀。室温避光保存15－20min。（3）样品制备：使用样品制备仪进行溶血和固定。（4）洗涤和离心：将制备样品管放置离心机内，580×g离心5min；离心后弃上清液。向含沉淀细胞的试管中加入pH值为7.2的PBS液1 ml，混匀。580×g再次离心5min，弃上清液，再次向含沉淀细胞的试管中加入pH值为7.2的PBS液1ml，混匀备用。（5）流式细胞仪检测：上机检测前，用荧光校准微球校正流式细胞仪光路和流路，使变异系数值（CV）在2.0之内。建立并选定流式细胞仪检测HLA－B27的方案。将对照管插入仪器的进样口，找出3组细胞，选择1个细胞群，调节确定合适的放大电压。将补偿管插入仪器的进样口，调节荧光补偿。将患者血样管插入仪器进样口，当标本的淋巴细胞计数＞5 000时，根据HLA－B27细胞数表达的百分比和平均荧光强度判断检测结果。（6）结果判断HLA－B27阳性结果判断方法为：B27表达的细胞数＞90%和平均荧光强度＞8。

1.3.2 实时荧光PCR法检测人类白细胞抗原HLA－B27步骤

（1）血样采集：空腹抽取静脉血2ml，乙二胺四乙酸三钾（EDTA－K3）抗凝。（2）提取基因组：取血液样本500μl，放入1.5ml离心管中，加入1ml的细胞裂解液，颠倒混匀，1 1500×g离心1min，弃去上清，留下细胞核沉淀。向离心收集到的细胞核沉淀中加入200μl缓冲液GS，再加入20μl蛋白酶K溶液和200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置15分钟，直至溶液变清亮。加入200μl无水乙醇，充分颠倒混匀。将上述所得溶液加入到吸附柱中，13 400×g离心30s，弃去收集管中废液。向吸附柱中加入500μl缓冲液GD，13 400×g离心30s，弃去收集管中废液。向吸附柱中加入700μl漂洗液，13 400×g离心30s，弃去收集管中废液。向吸附柱中加入500μl漂洗液，13 400×g离心30s，弃去收集管中废液。将吸附柱放回收集管，13 400×g离心2min，倒掉废液。将吸附柱置于室温放置15 min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱转入一个干净的离心管中，滴加50μl洗脱缓冲液TB，室温放置3min，13 400×g离心2min，将基因组收集到离心管中。（3）基因扩增：从试剂盒中取出PCR反应液，室温融化。分别向装有PCR反应液的管中加入1μl模板，盖紧管盖，置于PCR仪上按照以下程序进行扩增。基因扩增程序：37℃600s，1个循环；96℃ 900s，1个循环；96℃ 25s，62℃30s，72℃30s，40个循环。溶解曲线分析程序：95℃10s；72℃10s；95℃10s；50℃10s。（4）结果判读：当质控峰与B27峰在目标温度区间的荧光信号最大值的比值小于等于2.925，此样本为阳性标本。当质控峰与B27峰在目标温度区间的荧光信号最大值的比值大于2.925，此样本为阴性标本。

1.4 统计学分析

采用SPSS 10.0统计软件包进行统计学分析，2种检测方法检出阳性率比较采用配对χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流式细胞术和实时荧光PCR法检测两种方法同时检测 检测结果见表1。共检测138例患者（男性85例，女性53例），流式细胞术检出阳性为36例，实时荧光PCR法检出阳性为39例，经配对χ2＝1.33，两种方法的检出率差异无统计学意义（P＞0.05）。2种方法符合率为97.8%（135／138），见表1。

表1 两种方法同时检测结果比较

2.2 流式细胞术和实时荧光PCR法检测HLAB27同时检测出的阴性标本如图1所示，它们同时检测出的阳性标本如图2所示。

图1 阴性标本

图2 阳性标本

2.3 在流式细胞术检测HLA－B27发现7例可疑标本，即所谓双阳性标本（HLA－B27和 HLA－B7均表现为阳性），他们的共同特点是荧光强度＞8，但HLA－B27细胞表达百分比数不足90%，见表2。流式细胞术通常的报告的结果为阴性，但实时荧光PCR法并不都一致，见图3，A图两种检测方法结果不一致，B图两种方法检测结果均为阴性。

表2 可疑标本检测结果比较

图3 可疑标本

3 讨论

Chou等［3］在家族性研究中发现 HLA－B27是一个有用的预测指标，因为HLA－B27阴性个体中，发展为AS的可能性几乎是零，而在HLA－B27阳性的个体中，发生AS的可能性是20%－30%。因此，HLA－B27对临床诊断提供关键的支持依据。经过采用流式细胞术和实时荧光PCR法同时检测138例患者血中HLA－B27表达，发现两种检测方法符合率为97.8%，其准确性、可靠性和自动化程度完全符合临床检测要求。但又各有其优缺点。

流式细胞术检测HLA－B27原理是采用荧光标记的单克隆抗体与细胞表面的HLA－B27抗原相结合，然后用流式细胞仪检测HLA－B27表达的细胞数和荧光强度，判断结果。这种方法操作简单，自动化程度高，一份样品40分钟内便可得出结果，而且重复率好。但流式细胞术也有不足之处。由于HLA－B27抗体除了能和HLA－B27抗原结合之外，与HLA－B7抗原也有一定的交叉反应。正是因为HLA－B7抗原和HLA－B27抗原竞争性的与HLAB27抗体结合，所以HLA－B27检测中可能出现假阳性的可能。Macardle等［4］报道流式细胞术检测HLA－B27误差率为5%，其中部分原因就是HLAB7抗原阳性的患者，可能会给HLA－B27的判断造成误差。本研究采用HIA－B27／HLA－B7双标记荧光探针检测HLA－B27，其优点在于避免了假阳性结果的报告，但对于假阴性的误判难以克服。

实时荧光PCR法检测 HLA－B27原理，是在PCR反应液加入荧光染料，该染料能与双链DNA特异性结合，通过实时检测反应体系荧光信号强度，达到检测PCR扩增产物的目的。实时荧光PCR法直接检测 HLA－B27抗原的编码基因，不必有与HLA－B7产生交叉反应之虞，故能准确地做出判断。两种方法的检测结果有3例标本不符，主要原因是本研究中流式细胞术检测HLA－B27和HLA－B7两种抗原，如果标本HLA－B27平均荧光强度＞8而表达的细胞数＜90%，我们高度怀疑是HLA－B7抗原引起的干扰，进而临床上我们倾向于报告HLA－B27抗原阴性，但是这就会造成两种抗原都是阳性标本的漏检。我们分析了类似的7例标本，这些标本的共同特点是平均荧光强度＞8，而B27表达的细胞数＜90%，其中3例标本两种方法检测结果不符，4例标本结果完全符合。实验结果说明平均荧光强度＞8而B27表达的细胞数＜90%的情况下，流式细胞术已无能为力，提示需要采用微量细胞毒［5］或PCR方法进行确认，而实时荧光PCR法确实能弥补这一不足。拟采用流式细胞术检测样品，需当天处理，而且不能冻存。而采用实时荧光PCR法检测的样品的可以在－80℃长期保存。这样就为我们提出一种可采纳的方法：将流式细胞术检测数的双阳性标本放入冰箱冻存，待积攒到一定数量之后，用实时荧光PCR法作进一步确认。如果本室的实验条件不允许，也可集中送到其他实验室检测。为临床提供可靠和准确的数据。本研究中实时荧光PCR法与流式细胞术两种方法检测人类白细胞抗原HLA－B27的符合率高，虽然实时荧光PCR法的操作较流式细胞术繁琐，但在解决双阳性标本时具有优越性，使临床的检测结果更加准确和可靠。

［1］López de Castro JA.HLA－B27and thepathogenesis of spondyloarthropathies［J］.Immunol Lett，2007，108：27.

［2］Brown MA，Pile KD，Kennedy LG，et al.HLA class I associations of ankylosing spondylitis in the white population in the United Kingdom［J］.Ann Rheum Dis，1996，55：268.

［3］Albrecht J，Müller HA.HLA－B27typing by use of flow cytofluorometry［J］.Clin Chem，1987，33：1619.

［4］Macardle PJ，McEvoy R，Jovanovich S.HLA－B27expression by flow cytometry：an analysis of 7years quality assurance data［J］.J Immunol Methods，2000，243：51.

［5］楮为靖，张会英，高新生，等.流式细胞仪检测人类白细胞抗原－B27与微量细胞毒法的比较［J］.中华检验医学杂志，2008，31：520.