复合抑菌剂对希瓦氏菌抑制效果的研究

高 莹，娄永江

（宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江宁波315211）

复合抑菌剂对希瓦氏菌抑制效果的研究

高 莹，娄永江

（宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江宁波315211）

在单因素实验的基础上，根据中心旋转组合设计原理，考察了四种抑菌剂多糖、纳米银、茶多酚与ε-聚赖氨酸对腐败菌希瓦氏菌 （Shewanella sp.）的抑制作用。结果表明复合抑菌剂最佳配比为0.23%R-多糖、0.83‰纳米银、0.16‰茶多酚与0.43‰ε-聚赖氨酸，在此条件下抑菌率实测可达90%以上，且希瓦氏菌对该复合抑菌剂极度敏感，抑菌圈直径达到28.36mm。

希瓦氏菌，抑菌剂，响应面，管蝶法

水产品原料易于腐败变质，且微生物是造成其腐败变质的主要原因之一[1-2]。但是，并非所有微生物均是导致制品发生变质的直接原因，往往只有一种或几种特定微生物在整个腐败过程中起着主导作用，该菌即称之为特定腐败菌（specific spoilage organism，SSO）。故若加强对SSO的研究与控制，就可较好地降低水产品腐败速率，提高产品品质[3-5]。国内外对SSO的研究表明，希瓦氏菌（Shewanella sp.）或假单胞菌（Pseudomonas sp.）是导致温带海洋鱼类贮藏期间特别是冷藏时腐败变质的主要原因[6-10]，但针对这些腐败菌进行抑制的研究却较少。本文利用响应面法，研究了几种抑菌剂对希瓦氏菌生长繁殖的影响，以期为海产品的保鲜提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

希瓦氏菌ANA-3（Shewanella sp.ANA-3） 分离自腐败枪乌贼，经生理生化及16s RNA鉴定得到，斜面保存于冰箱备用；纳米银溶液 采用化学还原法制得，浓度为200μg/mL，颗粒直径≤15nm；ε-聚赖氨酸 浙江银象生物工程有限公司；茶多酚 余姚市惠得隆生物制品有限公司；R-多糖 北京星标智生物技术有限公司。将上述抑菌剂按实验要求，配制成溶液保存于试剂瓶中备用。并将抑菌液OD420mm与纯水OD420mm进行比较，发现无显著差异（P＞0.05）。说明待测抑菌液对实验测定结果无显著性影响。

分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液的制备 取一菌环希瓦氏菌，接种于300mL营养肉汤，30℃培养18~20h后，血球计数板计数，根据实验要求用灭菌营养肉汤稀释至适当浓度。

1.2.2 不同抑菌剂对希瓦氏菌生长影响测定 当希瓦氏菌培养至进入对数生长期（约3h）时，分别添加不同浓度抑菌剂，在30℃摇床中继续培养24h后，测定菌液OD420mm。

1.2.3 响应面优化抑菌剂组合方案 采用Design-Excerpt7.0.0软件，按照中心旋转组合设计（CCD）原理，以抑菌率作为响应值，设计四因素二次旋转组合实验，优化抑菌剂组合方案。实验安排及抑菌率计算公式如下：

抑菌率（%）=（OD420对照组-OD420实验组）/OD420对照组×100%

表1 四因素响应面分析实验因素设计表Table 1 Variables and levels in central composite design

1.2.4 组合抑菌剂敏感性测定 在超净工作台内，于每个培养皿中倒入约15mL营养琼脂培养基，待培养基凝固后，移取0.2mL希瓦氏菌菌液均匀涂布，静置30min后放入牛津杯，并在牛津杯中加入抑菌剂混合液0.2mL，30℃培养12h，测量抑菌圈直径。并以无菌生理盐水作阴性对照、1.00%山梨酸钾作阳性对照[11-12]。每种抑菌剂做3次平行。

2 结果与分析

2.1 不同抑菌剂抑制希瓦氏菌效果

图1 不同抑菌剂对菌液OD420值的影响Fig.1 OD420nmvalueofShewanellaatdifferentbacteriostaticagents

由图1知，当R-多糖、茶多酚、ε-聚赖氨酸以及纳米银的浓度分别小于0.20%、0.15‰、0.4‰、0.8‰时，菌液OD420mm值随着抑菌剂浓度的增加显著降低（P＜0.05），但当各抑菌剂浓度超过该临界点时，测定指标虽呈现下降趋势，但并不显著（P＞0.05）。出于成本考虑，本研究分别以0.20%、0.15‰、0.4‰、0.8‰作为R-多糖、茶多酚、ε-聚赖氨酸及纳米银的实验控制点。

2.2 组合抑菌剂配比条件的响应面优化

2.2.1 模型建立与显著性分析 模型可信性分析显示（见表3），模型校正决定系数R2adj=0.9705，说明所建模型可解释97.05%响应值的变异性；变异系数C.V=1.42%与精密度A.P=24.037，均在可接受范围内，说明该实验可信度与精密度均较高；此外，该实验模型拟合检测高度显著（P回归模型＜0.01），模型失拟性不显著（P失拟项＞0.05），说明该模型可较好反映实验自变量对应变量的影响，实验结果中无异常点，可用来预测实验响应值的变化。

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表2 响应面实验设计与结果Table 2 Central composite experimental design matrix and experimental results

二次回归模型为：

其中，二次项的系数表明所建抛物面开口向下，具有极大值点，可进行最优分析。四因素一次项与二次项对抑菌率均有非常显著的影响（P＜0.05），且根据F值可知，影响性X1＞X4＞X2＞X3；X1X2、X2X3与X2X4的交互作用显著，而X1X3、X1X4与X3X4的交互作用不显著（P＞0.05）。

2.2.2 因素作用分析

2.2.2.1 单因素效应分析 因素X1、X2、X3与X4对Y值均有显著性影响，故采用降维分析法，对4因素均进行单因子效应分析。单因素效应方程与曲线如表4与图1所示。

表4 单因素效应方程Table 4 Effect equations of single factor

表3 回归模型方差分析表Table 3 Analysis of variance for regression model

图2可见，4因素对响应值的影响均表现为曲线变化，且抑菌剂浓度发生相同编码值变化幅度时，X1对抑菌率的影响效应最大，X3影响效应最小，这与前面的方差分析结果一致。此外，当编码值达到表4中X分界点时，各个方程对应的响应值达到最大值；当编码值小于X分界点时，各因素呈现正效应；大于X分界点时，呈现负效应。

图2 单因素效应曲线Fig.2 Effect curves of single factor

2.2.2.2 交互作用分析 实验所得RSM三维图以及相应等高线见图3～图8。其中，等高线形状表明不同因素之间交互作用强弱，椭圆表明两者交互作用显著，圆形表明交互作用不具有显著性[13]，由此可得X1X2、X2X3与X2X4的交互作用显著，这与方差分析结果一致。这可能是由于纳米银离子可使细胞膜松散、破坏细胞结构从而形成通道，有利于其它抑菌剂进入细菌细胞内从而更加有效的达到抑制微生物生长繁殖的作用[14-15]。因此，只对X1X2、X2X3与X2X4之间的交互作用进行分析。将另两个因素固定在零水平，得到X1X2、X2X3与X2X4对抑菌率影响的方程如下：

此外，将方程与等高线结合可知，在所考察范围内，抑菌率随着各抑菌剂浓度的增加先增大，但当抑菌剂浓度达到一定程度后，抑菌率随各因素变化的幅度趋于平缓。

图3 R-多糖与纳米银响应曲面图Fig.3 Response surface for the interactive effects of R-polysaccharide and nano silver on the bacteriostatic rate

图4 R-多糖与茶多酚响应曲面图Fig.4 Response surface for the interactive effects of R-polysaccharide and tea polyphenol on the bacteriostatic rate

图5 R-多糖与ε-聚赖氨酸响应面图Fig.5 Response surface for the interactive effects of R-polysaccharide and ε-polylysin on the bacteriostatic rate

图6 纳米银与茶多酚响应曲面图Fig.6 Response surface for the interactive effects of nano silver and tea polyphenol on the bacteriostatic rate

图7 纳米银与ε-聚赖氨酸响应曲面图Fig.7 Response surface for the interactive effects of nano silver and ε-polylysin on the bacteriostatic rate

图8 茶多酚与ε-聚赖氨酸响应曲面图Fig.8 Response surface for the interactive effects of tea polyphenol and ε-polylysin on the bacteriostatic rate

联立方程，解得X1=0.534，X2=0.602，X3=0.235，X4=0.561，换算可知当R-多糖、纳米银、茶多酚与ε-聚赖氨酸的浓度分别为0.23%、0.83‰、0.16‰和0.43‰时，抑菌率达到最优值91.02%。

在上述优化条件下进行3次验证实验，得到的抑菌率为90.48%±0.09%，与预测值91.02%基本一致，说明所拟合模型可靠，优化效果显著，该实验设计适用于对复合抑菌剂组合方案进行参数优化。

2.3 抑菌剂敏感性测定

管蝶法结果如表5所示。表明腐败菌希瓦氏菌对组合抑菌剂以及山梨酸钾均表现出敏感性，但对复合抑菌剂更为敏感。

表5 抑菌剂抑菌效果Table 5 Inhibition results of different bacteriostatic agents

图9 希瓦氏菌对不同抑菌剂敏感度测定结果图Fig.9 The sensitivity results of Shewanella for different bacteriostatic agents

3 结论

3.1 通过响应面方法分析R-多糖、纳米银、茶多酚与ε-聚赖氨酸4因素对腐败菌希瓦氏菌抑制作用的影响，得到相应回归方程如下：

Y=88.47+3.02X1+2.75X2+0.81X3+2.94X4+0.61X1X2-0.061X1X3-0.40X1X4+0.68X2X3+0.69X2X4-0.23X3X4-2.95X12-3.01X22-2.25X32-2.75X42

方差分析显示，该模型拟合显著，相关性好，决定系数R2=0.9848，且失拟性不显著，说明所建方程可较好地预测抑菌率随各因素变化情况。

3.2 响应面优化得到的最佳抑菌剂组合方案为：0.23% R-多糖、0.83‰纳米银、0.16‰茶多酚与0.43‰ε-聚赖氨酸，此条件下抑菌率预测达到91.02%。

3.3 在优化条件下，抑菌率实测值为90.48%±0.09%，与预测值一致，说明响应面法的合理性与可行性。且牛津杯实验表明，希瓦氏菌对复合抑菌剂表现出极高的敏感度，效果显著优于1.00%山梨酸钾。这可能是由于纳米银具有破坏细胞结构、增加细胞通透性的作用，从而更有益于其它抑菌剂进入细菌体内达到更加有效的抑菌效果，但具体抑菌机制仍需进一步的研究与探讨。

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Study on antimicrobial effect of different bacteriostatic agents on Shewanella sp.

GAO Ying，LOU Yong-jiang
（Faculty of Life Science and Biotechnology of Ningbo University，Ningbo 315211，China）

On the basis of single-factor experiments，bacteriostasis effects of four bacteriostatic agents（polysaccharide，nano silver，tea polyphenol and ε-polylysin）on Shewanella sp.were studied by using the principle of central composite design.Results showed that the optimal amounts of R-polysaccharide，nano silver，tea polyphenol and ε-polylysin was 0.23%，0.83‰，0.16‰ and 0.43‰，respectively.With this compound bacteriostatic agents，the bacteriostatic rate was more than 90%.And the diameter of inhibition zone was 28.36mm，which indicated Shewanella sp.was sensitive for this complex preservative.

Shewanella sp.；bacteriostatic agent；response surface methodology；cylinder-plate method

TS202.3

A

1002-0306（2012）07-0088-05

2011－07－08

高莹（1987-），女，硕士，研究方向：食品科学。

浙江省“十一五”科技兴海重大科技项目（2009C03017-3）；宁波市农业重大攻关招标项目（2006C11001）