一株发酵乳杆菌的筛选鉴定及其高密度培养的研究

李 江，李 玉，曹月婷，荆 玮，董逸楠，路福平

(天津科技大学生物工程学院，工业发酵微生物教育部重点实验室，工业酶国家工程实验室，天津300457)

一株发酵乳杆菌的筛选鉴定及其高密度培养的研究

李 江，李 玉*，曹月婷，荆 玮，董逸楠，路福平

(天津科技大学生物工程学院，工业发酵微生物教育部重点实验室，工业酶国家工程实验室，天津300457)

自黑龙江鹤岗自制酸菜汁中分离得到两株乳杆菌，经16S rDNA序列分析鉴定均为发酵乳杆菌并命名为发酵乳杆菌L1和L3，其中L1具有良好的耐酸和耐胆盐能力。用改良MRS培养基对发酵乳杆菌L1 7L发酵罐的高密度培养进行了研究，通过补碱和补糖有效克服了发酵过程中产酸和碳源短缺对菌体生长的抑制，最高菌浓可达10.19 lgCFU/mL，较分批培养有显著提高，为发酵乳杆菌的工业化生产奠定了一定的基础。

发酵乳杆菌，耐酸，耐胆盐，高密度培养，分批补料培养

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

样品 取自黑龙江鹤岗的酸菜汁，样品放入密封瓶中保持4℃低温;MRS培养基 蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·7H2O 0.2g，磷酸氢二钾3g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，吐温80 1mL，水1L，pH6.2～6.6，115℃灭菌20min;改良MRS培养基 酪蛋白胨10g，酵母粉10g，葡萄糖10g，K2HPO43.5g，乙酸钠3g，MgSO4· 7H2O 0.4g，吐温80 1mL，水1L，pH6.8～7.0，115℃灭菌20min;脱脂乳培养基 脱脂乳粉(完达山)10g，水100mL，pH自然，115℃灭菌15min;酪蛋白胨 北京路桥技术有限责任公司;酵母粉 北京奥博星生物技术有限责任公司;牛胆盐 国药集团化学试剂有限公司。

PTC－200型 PCR基因扩增仪 MJ Research Inc.;SBA－40C型生物传感分析仪 山东省科学院生物研究所;厌氧培养箱 浙江义乌冷冻机总厂。

表1 分离出菌株的初步观察鉴定Table 1 Preliminary identification of isolated strains

1.2 实验方法

1.2.1 菌株的分离纯化 取酸菜汁1mL，接种于MRS培养基，37℃厌氧培养48h，将菌液逐级稀释至10－5～10－8。分别取0.1mL稀释液在添加1%(w/v) CaCO3的MRS固体平板上涂布，37℃厌氧培养48h。挑取有透明圈的单菌落在平板上划线培养，直到菌落的形态均一，分别挑取形态不同的菌落，做革兰氏染色，选取其中的革兰氏阳性菌进行凝乳实验(用接种针挑取菌落一环，接种于盛有10mL脱脂乳培养基的试管中，37℃厌氧箱中培养，观察凝乳情况，当开始结冻成形并出现少量乳清时，记录发酵时间，此为该菌株的凝乳时间)。

1.2.2 16S rDNA序列分析鉴定 细菌基因组总DNA的提取采用苯酚氯仿法。菌株的16S rDNA采用 通 用 引 物［12］， 正 向 引 物 为:5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3'，反向引物为:5'－GGCTGCTGGCACGTAGTTAG－3'，PCR反应程序如下:95℃预变性5min;94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，进行30个循环后72℃延伸10min。将PCR扩增产物送至华大基因测序，测序结果进行BLAST在线比对。

1.2.3 耐酸实验 将活化好的菌液以2%(v/v)的接种量分别接种于用HCl调节pH为1、2、3的MRS液体培养基中，以pH 6.5作为对照，37℃静置培养，在0、2、3h取样，利用倾注平板法进行活菌计数，检测菌株对酸的耐受性。

1.2.4 耐胆盐实验 将活化好的菌液以2%(v/v)的接种量分别接种于含0.1%、0.2%、0.3%(w/w)胆盐的MRS液体培养基中，以不含胆盐的MRS培养基做对照，37℃静置培养，在0、2、4、6、8h取样，用倾注平板法进行活菌计数。绘制菌株的生长曲线，比较菌株生长与胆盐含量的关系。

1.2.5 7L发酵罐分批培养 利用经过优化改良的培养基进行7L的发酵实验，装液量5L，初始pH为7，发酵温度37℃，每隔2h记录pH并取样测其活菌量和葡萄糖含量。

1.2.6 7L发酵罐补料培养 每隔2h测发酵液pH和葡萄糖含量，通过流加5mol/L的NaOH溶液以调节发酵液pH，补加50%(w/v)的葡萄糖溶液以维持发酵液中的碳源量进行发酵，每隔2h记录pH并取样测其活菌量和葡萄糖含量。

1.2.7 指标测定

1.2.7.1 活菌量的测定 平板计数法:梯度稀释后，倾注平板［13］，置于厌氧箱37℃培养48h后计数。

1.2.7.2 葡萄糖含量的测定 取1mL发酵液，6000r/min离心5min，取上清，稀释10倍后取25μL在SBA－40C型生物传感仪中进样进行测定。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离纯化

酸菜汁样品在添加1%(w/v)CaCO3的MRS培养基上生长出单菌落后，将有透明圈的菌根据菌落形态和菌体形态进行分类，得出五株菌，如表1所示。

由表1可知，L1、L2和L3为G+菌。通过凝乳实验发现L1和L3凝乳快，且为杆状，推测可能为乳杆菌。菌株L1和L3的菌落和菌体照片如图1。

图1 菌株L1和L3的菌落和菌体形态(×1000)Fig.1 Colonial morphology and thallus appearance of L.fermentum L1 and L3(×1000)

2.2 16S rDNA序列鉴定

对L1和L3进行基因组的提取和16S rDNA序列的扩增，扩增结果如图2所示。由图2可知，两株菌扩增基因片段长度均在1500bp左右，将扩增出的基因进行测序，测序结果经BLAST比对，结果显示L1和 L3与 L.fermentum KLDS 1.0615登 录 号EU419593.1的16S rDNA基因序列相似性分别为100%和99%，即确定将此两株菌均为发酵乳杆菌并命名为发酵乳杆菌L1和L3。

2.3 耐酸实验

乳酸菌要想达到益生的作用，必须能通过消化道定植于肠内，并且通常食品中的益生菌数量不低于107CFU/g时才能发挥益生功能。胃液是阻止大多数微生物进入肠道的天然屏障，胃液pH的大小根据饮食结构不同而波动很大，通常pH为2.5左右，空腹或食用酸性食品pH可达1.5，食用碱性食品pH可达4～5。所以具有耐胃液能力的乳酸菌才可能以一定的活菌数量进入肠道［14］，实验设计了pH为1、2、3的环境，菌体在其中的生长情况如表2所示。

图2 发酵乳杆菌L1和L3的16S rDNA基因扩增电泳图Fig.2 PCR amplification pattern of 16S rDNA from L.fermentum L1 and L3

表2 发酵乳杆菌L1和L3在不同pH中的存活率Table 2 Survival rate of L.fermentum L1 and L3 under different pH conditions

由表2可知，发酵乳杆菌L1和L3对低pH环境均有一定的耐受性，而L1菌种的耐受性更为明显。pH为1时，两株菌都不能生长;pH为2时，经过2h和3h后，菌株 L1的存活率分别是 32.76%和15.86%，其活菌量可保持在7 lgCFU/mL左右，而菌株L3的活菌数下降很快，存活率低至0.71%，活菌数只保持在5 lgCFU/mL以上;pH为3时，菌株L1的活菌含量保持在18.97%水平以上，而菌株L3在3h时只有2.22%的菌体存活。

2.4 耐胆盐实验

人体小肠中胆汁盐含量在0.03%～0.3%(w/w)范围内波动［15］，根据实验条件，设计了浓度为0.1%～0.3%(w/w)的模拟胆盐环境，菌体在其中的生长情况如图3所示。由图3可知，两株菌都显示出一定的胆盐耐受性，其中发酵乳杆菌L1在0.3%的胆盐浓度下仍可保持活菌量在7 lgCFU/mL以上并且在8h时活菌量已经回升，菌体处于生长时期，说明菌体可以在模拟肠道环境中生存，由此可见，发酵乳杆菌L1具有开发优良益生菌的潜力。

2.5 7L发酵罐分批培养

对发酵乳杆菌L1的培养基和培养条件进行了优化，利用优化后的改良培养基进行7L罐发酵实验，初始pH 7.0，发酵温度37℃，间歇搅拌发酵，发酵情况如图4所示。对图4的曲线进行分析，相对于三角瓶静置培养，在发酵罐中菌体对数期生长更为旺盛，达到最大活菌的时间也有所缩短，这对于发酵生产是有利的，但最大菌体量8.90 lgCFU/mL并没有比在三角瓶培养时提高很多，并且稳定期持续不久便进入衰亡期，可能因为残糖量在18h时已经维持在很小的水平，碳源的短缺导致菌体无法继续生长，另外，发酵乳杆菌代谢产酸越来越多，低pH和过量的酸造成的恶劣环境使菌体不能处于活跃的生长状态，所以本研究设计了在发酵过程中补糖和添加碱中和剂的实验，以促进发酵乳杆菌的生长。

图3 发酵乳杆菌L1和L3在不同胆盐浓度下的生存能力Fig.3 Growth of L.fermentum L1 and L3 exposed to different concentrations of bile salt

图4 发酵乳杆菌L1在7L罐的发酵情况Fig.4 Batch fermentation of L.fermentum L1 in 7L fermenter

2.6 7L发酵罐补料培养

经过实验优化，发酵过程中当pH下降至5.9时，开始流加5mol/L的NaOH，维持pH6.0左右，当葡萄糖含量降至2g/L时开始补加葡萄糖，维持葡萄糖含量在2～4g/L。发酵情况如图5所示。由图5可知，通过添加NaOH维持pH在5.9～6.1，添加葡萄糖溶液维持葡萄糖含量在2～4g/L，菌体生长更加旺盛，有效解除了产酸和碳源短缺对菌体生长的抑制，生长对数期和稳定期均有所延长，最高活菌量有显著提高，24h时活菌数最高，达到10.19 lgCFU/mL，较无补料时增长显著。

图5 发酵乳杆菌L1在7L罐的补料发酵情况Fig.5 Fed－batch fermentation of L.fermentum L1 in 7L fermenter

3 结论

自黑龙江鹤岗自制的酸菜汁中分离得到两株乳杆菌，经16S rDNA序列鉴定均为发酵乳杆菌，其中L1具有良好的耐酸和耐胆盐特性。用优化后的MRS培养基对发酵乳杆菌L1的7L发酵罐高密度培养进行了研究，通过补碱和补糖有效克服了发酵过程中产酸和碳源短缺对菌体生长的抑制，发酵最高菌浓可达 10.19 lgCFU/mL，较分批培养的 8.90 lgCFU/mL有显著提高，达到了高密度培养的目的。

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Screening identification and high－density cultivation of Lactobacillus fermentum

LI Jiang，LI Yu*，CAO Yue－ting，JING Wei，DONG Yi－nan，LU Fu－ping
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes，College of Biotechnology，Tianjin University of Science＆Technology，Tianjin 300457，China)

Two Lactobacilli were isolated from the sample of traditionally home－made chinese pickle juice in Hegang，Heilongjiang province of China.The strains were identified as Lactobacillus fermentum by using 16S rDNA of molecular methods and were denominated L1 and L3.L.fermentum L1 exhibited a stronger tolerance to 0.3%bile salt and low pH than L3.After high－density cultivation by adding alkali and glucose in enrichment medium with optimized conditions，the count of living cells in fermentation broth could reach to 10.19 lgCFU/mL，which was much higher than the number of batch culture.The result could provide some useful data to the industrial application of L.fermentum.

Lactobacillus fermentum;acid tolerance;bile salt tolerance;high－density cultivation;fed－batch fermentation

TS201.2

A

1002－0306(2012)08－0211－04

发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)作为潜在的益生菌，广泛分布于人和动物的胃肠道中，是肠道、口腔和阴道的正常菌群［1］，目前发酵乳杆菌多用于豆乳发酵［2］，香肠发酵［3］，许多报道指出发酵乳杆菌具有水解胆盐，降胆固醇的功能［4－6］，它能够调节宿主体内微生物菌群的平衡，可以通过口服而到达肠道［7］，很好地吸附在小肠的上皮细胞［8］。并产生表面活性成分而阻止有害菌对肠道的粘附，而改善宿主体内系统环境，对宿主健康具有促进作用［9］。由于发酵乳杆菌的益生特性不断被发掘出来，其在食品发酵和医疗保健等领域的应用也显得十分广阔［1］，然而只有当菌体耐受消化道的不良环境，活着到达并定植于宿主肠道，且具有一定的细胞密度，才能发挥其益生作用［10－11］，因此发酵乳杆菌的高密度培养显得十分重要。本研究筛选出一株具有耐受胃肠道环境的发酵乳杆菌，利用优化后的培养基进行7L发酵罐补料发酵，进而为该菌制剂的工业化生产奠定了基础。

2011－07－22 *通讯联系人

李江(1987－)，男，硕士研究生，研究方向:益生菌的研究和生产。

天津市科技计划项目(10ZCKFNC01700);国家自然科学基金(青年科学基金项目)(20806060)。