基于混料实验设计优化鱿鱼甲醛复合抑制剂

苗林林，朱军莉，励建荣

(浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江省食品安全重点实验室，浙江杭州310035)

基于混料实验设计优化鱿鱼甲醛复合抑制剂

苗林林，朱军莉*，励建荣*

(浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江省食品安全重点实验室，浙江杭州310035)

为了研发水产品内源性甲醛的控制新技术，本文利用SAS软件的单纯型格子混料设计进行秘鲁鱿鱼甲醛复合抑制剂的优化。确定了茶多酚、氯化钙和氯化镁三种甲醛抑制剂的最佳配比为0.026%、0.642mmol/L、0.332mmol/L。通过模型的建立得到响应值与三种物质配比之间的回归方程，其中茶多酚对鱿鱼甲醛的减少率影响最大，而氯化钙对二甲胺的减少率影响最大。方差分析和验证结果表明，该模型能够准确可靠的预测响应值，并且甲醛抑制剂在高温及pH6.0时能有效降低鱿鱼中甲醛和二甲胺含量。因此，该复合抑制剂可用于鱿鱼制品高温加工过程中内源性甲醛生成的控制。

混料设计，甲醛，抑制剂，鱿鱼

混料问题是近三十年来新发展起来的十分活跃的统计分支，自1955年Claringbold［1］提出到目前为止，许多统计学家建立了适合于不同数据结构或各种统计目的所需要的混料模型，包括单纯形格子混料设计［2］、单纯形重心设计等多项式混料模型［3］。单纯形格子设计又称单形点阵设计，其特点是实验点可以取在正规单纯形的格子点上，保证了实验点分布均匀且计算简单、准确，回归系数只是相应格子点响应值的简单函数。因设计模型较简单、设计方便，被广泛应用在果冻、果茶、糕点配料等食品工业领域［4］。近年来水产品安全日益受到关注，特别是鱿鱼等大宗水产品所面临的甲醛含量严重超标问题。甲醛为较高毒的物质，已经被世界卫生组织确定为致癌和致畸形物质，在我国有毒化学品优先控制名单上高居第二位［5］。水产品甲醛问题不仅严重影响了鱿鱼等水产品加工行业的发展，而且对食用安全也提出了挑战。因此，研发水产品中甲醛的控制关键技术，提高质量和食用安全性，已成为迫切之需。目前，研究学者在水产品内源性甲醛的控制方面进行了初步探索，Herrera等［6］研究发现在冻藏的蓝鳕鱼糜中加入麦芽糊精和蔗糖能显著抑制甲醛的产生; Racicot［7］报道H2O2能有效降低红鳕鱼糜中甲醛和二甲胺的含量;植酸和醋酸对秘鲁鱿鱼氧化三甲胺酶活性有抑制作用［8］。然而，目前仍无可应用于水产品加工的甲醛控制技术。本课题组在降低鱿鱼甲醛含量积累了一定的工作基础，俞其林［9］首次将茶多酚作为捕获剂成功应用于鱿鱼制品，将甲醛含量降低到安全限量以下。然而，较高浓度茶多酚应用对鱿鱼制品的色泽有较大影响，并且产品货架期中甲醛仍有增加的趋势。为此，课题组进一步筛选和优化了一系列的甲醛生成抑制剂［10］。本研究基于混料实验设计原理，将茶多酚、钙盐和镁盐三种显著抑制秘鲁鱿鱼中甲醛形成物质进行复合，并验证其效果，进一步分析该复合甲醛抑制剂的作用条件，为获得一种高效、低廉的复合甲醛抑制剂奠定良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

秘鲁鱿鱼 浙江兴业集团有限公司;茶多酚浙江大学茶叶研究所，纯度98%;对甲苯磺酰氯 分析纯，国药集团试剂有限公司;二甲胺盐酸盐 分析纯，Sigma公司;氯化钙、氯化镁、甲苯、氢氧化钾、2，4－二硝基苯肼 分析纯，上海化学试剂公司;甲醛标准溶液 分析纯，国家环保总局;甲醇 色谱纯，TEDIA公司。

Agilent GC6890气相色谱 配有 FID检测器，Agilent公司;Agilent HPLC1100高效液相色谱仪 配有Agilent ODS2－C18柱及紫外检测器，美国安捷伦科技公司;高速冷冻离心机 Sigma公司;漩涡混合器 太仓市科教器材厂;AR2140电子天平 美国Ohaus公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鱿鱼上清提取 将冷冻鱿鱼在室温下解冻，去皮，去除鱿鱼胴体薄薄的一层表层和内层，将鱼肉切片，在匀浆机中匀浆。称取5g样品，加入2倍的Tris－乙酸缓冲液(pH7.0)匀浆(W/V)，4℃下，5000r/min离心20min，取上清液4℃储藏备用。

1.2.2 甲醛检测方法 根据本实验建立的方法［11］略有改进，利用高效液相色谱法测定甲醛含量，甲醛与2，4－二硝基苯肼于60℃水浴衍生化生成2，4－二硝基苯腙，经 ODS－C18柱分离，紫外检测器于波长355nm下检测，以保留时间定性，峰面积定量，间接测出甲醛含量。测定时取 1mL样品溶液，加入DNPH衍生剂0.5mL，60℃下衍生15min，流水冷却，0.45μm滤膜过滤后，取20μL进样检测。

1.2.3 二甲胺检测方法 二甲胺测定方法采用贾佳建立的气相色谱法［12］，取2mL三氯乙酸提取液，定容到5mL，加入2mL 65%KOH，对甲苯磺酰氯－甲苯溶液2mL，60℃水浴加热1h，取出冷却后振荡3min，然后进行GC－FID分析。

1.2.4 混料实验设计［13］对3个作用物质选用10组不同配比的实验，以甲醛和二甲胺的减少率为影响因素，考察各物质的主效应和交互作用。具体为取鱿鱼上清液10mL置于具塞比色管中，按照一定浓度添加复合甲醛抑制剂溶液5mL，盖上塞子置于100℃水浴锅中加热5min，取出流水冷却，加入1mL 7.5%三氯乙酸，待检。

1.2.5 验证实验 根据优化实验设计获得的最佳配方，应用于秘鲁鱿鱼高温处理条件下甲醛的抑制，分析其结果是否与预测的相符合，具体为将最佳的甲醛复合抑制剂和鱿鱼上清在100℃作用5min后，检测甲醛和二甲胺含量。

1.2.6 复合甲醛抑制剂反应条件的优化 将复合甲醛抑制剂溶液按一定浓度加入鱿鱼上清液中，在反应温度80℃、反应时间30min的条件下，考察pH为3、4、5、6、7、8、9时对鱿鱼上清甲醛和二甲胺含量的影响;在pH6.0、反应30min条件下，考察反应温度20、40、60、80、100℃对鱿鱼上清甲醛和二甲胺含量的影响;在pH6.0、反应温度80℃的条件下，考察反应时间15、30min，1、2、4、6h对鱿鱼上清甲醛和二甲胺含量的影响。

1.2.7 数据处理 采用SPSS17.0对数据进行计算和分析，采用Origin 8.0作图。单因素方差分析用来比较各组间的差异，p＜0.05认为有统计学显著性差异(*)，p＜0.01认为有统计学极显著性差异(＊＊)。

2 结果与分析

2.1 复合甲醛抑制剂的混料实验设计

运用SAS软件，以甲醛抑制剂茶多酚(A)、氯化钙(B)和氯化镁(C)三种物质为参数，其中茶多酚最低值和最高值设计为0和1%，氯化钙和氯化镁最低值和最高值为0和1mmol/L，以秘鲁鱿鱼上清中甲醛和二甲胺的减少率为响应值，采用单纯型格子法选取实验点进行混料设计，实验设计见图1。10组对鱿鱼上清甲醛和二甲胺含量的影响见表1。

图1 单纯型格子混料实验设计Fig.1 Simplicity grid mixture design

表1 复合甲醛抑制剂混料实验结果Table 1 The results of centroid mixture design of compound formaldehyde inhibitors

表2 回归方程的方差与显著性分析Table 2 Square and significant analysis of regression equation

表3 拟合统计Table 3 Fit statistics

根据表1通过SAS进行回归性分析，得到的回归方程:

甲醛 FA(Y1)=100.2197A+81.4181B+ 10.84847C+29.64856AB+5.729033AC+167.2907BC

二甲胺DMA(Y2)=26.39681A+39.99622B+ 23.38225C－11.6298AB+54.77995AC+21.92964BC

对回归结果进一步优化分析，图2为三因素对甲醛减少率和二甲胺减少率的影响的预测概貌图。由表1和图2结果显示，茶多酚添加量越大，鱿鱼上清中甲醛减少率越高，而二甲胺的减少量呈现相反的趋势，茶多酚添加量在0.33%～1.00%时甲醛的减少率高于90%以上。氯化钙对甲醛减少率的影响呈现抛物线型，在0.59mmol/L时甲醛减少最大，而对二甲胺减少率的影响呈倒抛物线型。甲醛的减少率随着氯化镁的添加量增加而下降，而二甲胺的减少呈现抛物线，在0.49mmol/L时达到峰值。

2.2 模型的建立及显著性检验［14］

采用SAS对表1中的数据进行二次多项式回归拟合，得到甲醛和二甲胺与茶多酚、氯化钙和氯化镁添加量的回归系数及显著性，结果见表2、表3。

结果可见，三种抑制剂对甲醛和二甲胺减少率的影响都是极显著的，二次模型的 P值分别为0.0154和0.0466，回归方程达到显著水平。回归模型的确定系数R2=88.96%和85.75%，调整确定系数R2=82.67%和67.93%，说明82.67%和67.93%的实验数据的变异性可用此回归模型来解释，在实验范围内该模型能较好地解释响应值的变化，即该模型在被研究的整个回归区域拟合较好，可用来进行响应值预测。

图2 三种抑制剂对甲醛和二甲胺减少率影响的预测概貌图Fig.2 Forecast map for effect of three inhibtors on the reducing rate of formaldehyde and dimethylamine

混料设计可以根据各组分的三元等值线图直观地观察各组分间的变化对指标的影响。图3为茶多酚、氯化钙和氯化镁3种组分不同配比条件下甲醛和二甲胺减少率的等值线图。结果表明，甲醛减少率的最大值在靠近茶多酚和氯化钙区域，减少氯化镁的添加量有利于降低鱿鱼中的甲醛含量，茶多酚是影响甲醛减少率的最大因素。而二甲胺减少率的最大值更靠近氯化钙，表明氯化钙对降低鱿鱼二甲胺含量影响最大，氯化镁次之，茶多酚最小。前期研究已经发现，0.05%的茶多酚用于秘鲁鱿鱼丝的生产会影响鱿鱼丝产品的感官品质［9］，结合成本的考虑，减少茶多酚的用量。因此，最佳复合甲醛抑制剂的配比确定为茶多酚0.026%、氯化钙0.642mmol/L、氯化镁 0.332mmol/L，此时预测的甲醛减少率为95.1%，二甲胺减少率为39.3%。

图3 混料设计的等值线图Fig.3 Isoline of mixture design

2.3 验证实验

为了验证模型预测的准确性，按配比将茶多酚、氯化钙和氯化镁分别为 0.026%、0.642mmol/L和0.332mmol/L添加到秘鲁鱿鱼上清中，高温处理后测定甲醛和二甲胺减少率。结果表明，鱿鱼上清中甲醛和二甲胺的抑制率分别为94.5%和41.3%，与预测值分别相差0.6%和2.0%。因此，结果表明采用该混料设计复合甲醛抑制剂配方具有准确性和可靠性的特点。

2.4 复合甲醛抑制剂反应条件的优化

图4 处理pH、温度和时间对鱿鱼上清高温甲醛和二甲胺含量的影响Fig.4 Effect of pH，temperature and time on content of formaldehyde and dimethylamine in squid supernatant

进一步分析了茶多酚、氯化钙和氯化镁复合甲醛抑制剂的高温反应条件，见图4。结果显示，在pH 5.0～7.0时鱿鱼上清中甲醛减少率显著增加，pH 7.0～9.0时甲醛减少率逐步下降，而pH对二甲胺的减少率无显著影响，其中pH5.0作用效果最理想。复合抑制剂在弱酸性条件下有利于降低鱿鱼中的甲醛含量，其成分茶多酚随着pH增加(pH＞4)可以促进其与甲醛的缩合反应［9］。随着处理温度的升高，复合抑制剂对鱿鱼上清中甲醛和二甲胺减少率都呈现显著上升的趋势。随着加热时间的延长，甲醛和二甲胺的含量也显著降低，其中甲醛减少率在0.5h时即达到最高值93.4%，而二甲胺的减少率在2h时达到最高点58%。在鱿鱼制品加工生成过程中，高温工艺蒸煮和焙烤工艺是甲醛生成关键控制点。因此复合甲醛抑制剂的应用有利于降低高温加工中甲醛的控制。

3 结论

本研究选取能显著降低秘鲁鱿鱼高温甲醛生成的三种抑制剂茶多酚、氯化钙和氯化镁，通过SAS中单纯型格子混料实验设计最终确定出它们的最佳配比为茶多酚0.026%、氯化钙0.642mmol/L、氯化镁0.332mmol/L。建立了预测模型，并且通过方差分析确定了模型的显著性。最后根据预测的比值进行验证实验，得到与预测值相近的结果，证明了该实验方法的可靠性和准确性。该复合甲醛抑制剂在高温处理条件下能有效降低鱿鱼中甲醛和二甲胺含量，可用于鱿鱼制品加工过程中甲醛的控制。

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［3］Henry Scheffe.The simplex－centroid gesign for experiment with mixtures［J］.Journal of the Royal Statistical Society，Series B (Methodological)，1963(4):235－238.

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［12］贾佳，朱军莉，励建荣.气相色谱－氢火焰离子检测器检测海产品中的二甲胺［J］.食品科学，2009，30(6):167－170.

［13］黄燕，吴平.SAS统计分析及应用［M］.北京:机械工业出版社，2006.

Optimization of compound inhibitors of formaldehyde in the jumbo squid(Dosidicus gigas)based on mixture design

MIAO Lin－lin，ZHU Jun－li*，LI Jian－rong*
(College of Food Science and Biotechnology，Zhejiang Gongshang University，Food Safety Key Lab of Zhejiang Province，Hangzhou 310035，China)

In order to research a new technique of formaldehyde control in the aquatic products，mixture design of SAS software was applied to optimizing compound inhibitors of formaldehyde in the jumbo squid.The best mixture radio of tea polyphenol，calcium chloride and magnesium chlorid was 0.026%，0.642mmol/L，0.332mmol/L，respectively.The model established to predict the equation between responses and three substances mixture radio was obtained by regression analysis.Tea polyphenol had the greatest effect on the reducing rate of formaldehyde，while calcium chloride had the greatest effect on the reducing rate of dimethylamine in squid.The data of analysis of variance and demonstration test indicated that the established models and regressive equation were significance，and could predict the responses value accurately and reliably.The inhibitors reduced effectively the content of formaldehyde and dimethylamine treated at high temperature and pH 6.0.Therefore，the compound inhibitors could be applied to control formaldehyde formation during the squid products thermal processing.

mixture design;formaldehyde;inhibitor;squid

TS202

A

1002－0306(2012)08－0348－04

2011－08－08 *通讯联系人

苗林林(1985－)，女，硕士研究生，研究方向:食品检测。

国家自然科学基金(31000761);浙江省自然科学基金项目(Y3090246);国家质检总局项目(2009IK180);教育部博士点基金优先发展领域课题(20113326130001)。