毛细管电泳法对乳及乳制品中乳源蛋白的研究

田 兰，马晓丽，陈春丽，孟 磊，李新霞

(新疆医科大学药学院分析测试中心，新疆乌鲁木齐830011)

毛细管电泳法对乳及乳制品中乳源蛋白的研究

田 兰，马晓丽，陈春丽，孟 磊，李新霞*

(新疆医科大学药学院分析测试中心，新疆乌鲁木齐830011)

采用毛细管电泳方法对原料乳、市售鲜奶、不同厂家的巴氏灭菌乳、不同厂家和产地超高温灭菌乳(UHT)、调味乳、乳酸饮料、复原乳、酸奶、奶粉中蛋白成分进行检测。选择聚乙烯醇涂层毛细管，采用柠檬酸缓冲体系，在紫外检测214nm、分离电压20kV条件下对乳及乳制品中的α一乳白蛋白(α－La)、β一乳球蛋白(β－Lg)、α－酪蛋白(α－CN)、β－酪蛋白(β－CN)和k－酪蛋白(k－CN)进行分离测定。结果表明:五种蛋白的含量在原料乳(巴氏灭菌乳、市售鲜奶)、UHT乳、酸奶、调味乳、乳酸饮料、复原乳中依次降低，而UHT乳含量随保质期的增加而减少，奶粉中蛋白质含量因其适应人群而有差异。乳及乳制品中蛋白质的含量与其存在形式、产地及加工工艺相关。

高效毛细管电泳，牛奶，乳制品，蛋白

乳及乳制品具有较高的营养价值，是人体获取蛋白质的重要途径。近年来，国内乳制品掺假现象严重，如三聚氰胺、皮革水解蛋白等物质的非法添加，严重损害消费者的利益和健康。国家制定的常规检验方法，不能将乳品中掺入的非乳蛋白区别检测。因此，从乳制品的特征性成分—乳源蛋白出发，对其进行定性定量表征，并由此对乳及乳制品在生产、流通、储存各个环节的质量品质进行分析、评价、控制，对于乳品行业的良性发展具有重要的意义［1－2］。鲜牛乳含有3.0%～3.5%蛋白质，其中80%为酪蛋白(CN)，15%为乳清蛋白。酪蛋白分别为: α－酪蛋白(α－CN)，β－酪蛋白(β－CN)，k－酪蛋白(k－CN)，乳清蛋白是在牛乳清液中，此类蛋白质主要是α－乳白蛋白(α－La)和β－乳球蛋白(β－Lg)。毛细管电泳法被证明是一种非常有效地检测乳蛋白的方法和控制乳制品质量的技术［3－5］。本实验采用毛细管电泳方法对原料乳、市售鲜奶、不同厂家的巴氏灭菌乳、不同厂家和产地超高温灭菌乳(UHT)、调味乳、乳酸饮料、复原乳、酸奶、奶粉中蛋白成分进行检测。考察乳品的存在形式、产地及加工工艺等对乳源蛋白含量的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

表1 方法的分析特征Table 1 Analytical characteristics of the method

原料乳 取自本地一乳品生产厂家;鲜奶 本地集市;其它样品 均购自本地超市;α－乳白蛋白(α－La)、β－乳球蛋白(β－Lg)、α－酪蛋白(α－CN)、β－酪蛋白(β－CN)、k－酪蛋白(k－CN)标准品 美国Sigma公司;羟丙基甲基纤维素(HPMC) 进口分装;DL－二硫苏糖醇(DTT，生物试剂) 德国Merk公司;三羟甲基胺基甲烷(Tris) 上海蓝季科技发展有限公司;柠檬酸、柠檬酸钠、尿素、磷酸和氢氧化钠均为分析纯。

P/ACE MDQ毛细管电泳仪(配有紫外检测器)、聚乙烯醇涂层毛细管柱(65cm×50μmI.D.，有效长度47cm) 美国Beckman公司;Satorius普及型 PB－10pH计 赛脱利斯科学仪器(北京)有限公司;MS3 basic涡旋振荡器 德国IKA;Milli－Q Advantage A10超纯水仪 美国 Millipore公司;TGL－16G离心机 上海菲恰尔分析仪器有限公司;KQ－3200DV型数控超声清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验条件

1.2.1.1 运行缓冲液制备 准确称取0.2954g柠檬酸钠，0.156g二硫代苏糖醇(DTT)，2.0111g三羟甲基胺基甲烷(Tris)，置于100mL容量瓶中，加入6mol/L尿素溶液75mL，用H3PO4调节pH至8.0，置于冰箱中备用。

1.2.1.2 样品缓冲液制备 准确称取4.2083g柠檬酸，0.5828g柠檬酸钠，0.05%羟丙基甲基纤维素，置于100mL容量瓶中，加入6mol/L尿素溶液75mL，用1mol/L NaOH调节pH至3.0，备用。

1.2.1.3 操作条件 分离电压20kV;压力进样0.5psi，时间5s;柱温:40℃;紫外检测波长:214nm;毛细管两次进样之间用水冲洗5min，柠檬酸缓冲液冲洗5min，在1min时自动调零。

1.2.2 样品处理

1.2.2.1 原料乳、液态奶样品的配制 将样品与样品缓冲溶液按1∶4(V/V)的比例混合，室温下放置1h，10000r/min离心，取清液，用0.45μm的滤膜过滤后直接进样。

1.2.2.2 酸奶样品 称取0.4g酸奶，加样品缓冲溶液约1.6mL，于离心管2mL处，混合，室温下放置1h，10000r/min离心，取清液，用0.45μm的滤膜过滤后直接进样。

1.2.2.3 奶粉样品的准备 称取1g奶粉，溶于10mL水中，超声振荡使其充分溶解平衡。将样品溶液与样品缓冲溶液按1∶4(V/V)的比例混合，室温下放置1h，10000r/min离心，取清液，用0.45μm的滤膜过滤后直接进样。

1.2.3 标准溶液的配制 分别配制 α－La、β－Lg、α－CN、β－CN、k－CN的标准储备液15、20、30、40、20mg/mL，并置于冰箱中保存。上述标准溶液均同样经样品缓冲液处理后进样。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 线性范围 在1.2.1.3操作条件下，以五种标准蛋白的峰面积为纵坐标，以标样的浓度为横坐标，绘制标准曲线，并利用最小二阶乘法进行线性回归，得到各蛋白的线性范围、回归方程及相关系数，结果如表1所示。

图1 五种乳蛋白标准品图谱Fig.1 Electropherograms of five kinds of milk protein standards

2.1.2 精密度 取同一样品溶液，在1.2.1.3操作条件下，连续进样6次，记录色谱峰面积，计算进样峰面积，得RSD结果如表2所示。

表2 乳蛋白的RSD(n=6)Table 2 RSD of milk proteins(n=6)

2.1.3 回收率 精密量取适量液态奶样品，平行取12份，3份空白，其余9分别加入低中高三种浓度的标准品溶液，按1.2.2.1方法处理，在1.2.1.3操作条件下测定，加标回收率测定结果如表3所示。

2.1.4 稳定性

2.1.4.1 测试稳定性 将样品按1.2.2.1项方法处理之后，在0，12，24，36，40，48，60，64，68，72h按1.2.1.3操作条件下测定，结果如表4所示。

结果显示，样品处理完之后需在64h内完成测定。

2.1.4.2 储存稳定性 将样品置于4℃冰箱保存，分别于24，36，48，72h按1.2.2.1项进行样品处理，测定，并考察于－18℃保存24h情况，结果如表5所示。

结果显示，样品可在4℃冰箱中保存72h，不适合在－18℃冰箱中存储。

表4 乳蛋白测试稳定性Table 4 Stability of milk protein during testing

表5 乳蛋白储存稳定性Table 5 Storing stability of milk protein

表3 加标回收率(n=3)Table 3 Recoveries of standard addition(n=3)

2.2 样品测定

2.2.1 液态奶测定 选择原料乳、市售鲜奶、不同厂家的巴氏灭菌乳、不同厂家、产地及保质期的超高温灭菌乳(UHT)、调味乳、乳酸饮料、复原乳进行测定。将样品按1.2.2.1项的方法处理之后，在1.2.1.3操作条件下测定，结果如表6所示。

图2 液态奶样品图谱Fig.2 Electropherograms of liquid milk

2.2.2 酸奶测定 选择本地产的不同厂家生产的酸奶样品进行测定。将样品按1.2.2.2项方法处理之后，在1.2.1.3操作条件下测定，结果如表7所示。

2.2.3 奶粉测定 选择不同适宜人群的奶粉样品进行测定。将样品按 1.2.2.3项方法处理之后，在1.2.1.3操作条件下测定，结果如表8所示。

3 讨论

3.1 实验对于同一产地不同品牌不同保质期的原料乳、巴氏灭菌乳、超高温灭菌乳、调味乳、乳酸饮料以及同一品牌不同产地的液体乳品进行测定，从表6可以看出，原料乳、市售鲜奶、巴氏灭菌乳的蛋白含量接近，在同类产品中最高;其次是超高温(UHT)灭菌乳，UHT灭菌乳蛋白含量随着保质期增长而下降;调味乳的蛋白质含量与同保质期的UHT灭菌乳相比要低;乳酸饮料中蛋白质含量远远低于鲜奶;说明加工工艺会影响鲜奶及乳制品的蛋白质含量。在对同一产地不同品牌及同一品牌不同产地的液态奶测定的结果显示，产地及品牌(即奶源)的差异会造成蛋白质含量的差异。在对市售标注复原乳的样品测定中未检出乳蛋白成分，农业部标准中复原乳的检测测定以糠氨酸和乳果糖含量作为定量检测的依据，检测前处理过程步骤较为繁琐，时间长，用高效毛细管电泳的方法区别鲜奶及复原乳也许是一条可行的路径。

表6 液态奶样品测定Table 6 Samples determination of liquid milk

表7 酸奶样品测定结果Table 7 Samples determination of sour milk

表8 奶粉样品测定结果Table 8 Samples determination of milk powder

图3 酸奶样品图谱Fig.3 Electropherograms of sour milk

图4 奶粉样品图谱Fig.4 Electropherograms of milk powder

3.2 本方法也适用于酸奶及奶粉中乳蛋白的测定，从表7、表8中看出，同产地不同品牌的酸奶由于奶源及加工工艺的差异，蛋白质含量也有差异;奶粉由于适用的人群不同蛋白含量有相应的变化，这些差异变化都可以用高效毛细管电泳方法检测出来。本方法不仅适用于对于成品乳制品蛋白含量的检测，也可以作为乳品企业从收购原料品质优劣、中间工艺控制到产品储存等各个环节控制乳品质量的手段。

4 结论

乳及乳制品中蛋白质的含量与其存在形式、产地及加工工艺相关。毛细管电泳方法是一种测定乳及乳制品中乳源蛋白的有效手段，乳蛋白是乳及乳制品中重要的营养组成，对乳蛋白含量的测定避免了非乳蛋白的干扰，既为乳制品质量提供了有效控制的途径，也可以作为营养评价的依据。

［1］宋宏新，柏红梅，薛海燕，等.基于乳源蛋白质分析的乳品质量检测技术探讨［J］.食品工业科技，2008，29(9):298－301.

［2］李春，刘丽波，刘宁.毛细管电泳技术评价乳制品质量的研究［J］.食品工业科技，2008，29(5):288－290.

［3］Patrick C，Samson O A，Roberta B.A study of polymorphism in milk proteins from local and imported dairy sheep in Australia by capillary electrophoresis［J］.LWT，2006，39:63－69.

［4］Heck J M L，Oliemanb C，Schenninkc A，et al.Estimation of variation in concentration，hosphorylation and geneticpolymorphism of milk proteins using capillary zone electrophoresis［J］. International Dairy Journal，2008，18:548－555.

［5］刘婷，姜金斗，刘宁.3种毛细管电泳方法分析牛乳蛋白的比较［J］.食品科技，2007(8):214－218.

Study on milk proteins in milk and milk products by capillary electrophoresis

TIAN Lan，MA Xiao－li，CHEN Chun－li，MENG Lei，LI Xin－xia*
(Analysis and Test Center of Pharmacy College of Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China)

The contents of milk protein were determined by capillary electrophoresis in raw milk，fresh milk in market，pasteurized milk from different plants，ultra－high temperature(UHT)milk from different plants and fields，sterilized flavor milk，lactic acid beverage，reconstituted milk，sour milk and milk powder.The proteins of α－La，β－Lg，α－CN，β－CN and k－CN were separated and analyzed by using polyvinyl alcohol coated capillary column and citric acid buffer solution with running voltage of 20kV and UV detection at 214nm.The results showed that the contents of five proteins decreased systematically in raw milk(fresh milk，pasteurized milk)，UHT milk，sour milk，sterilized flavor milk，lactic acid beverage and reconstituted milk.And the contents of proteins in UHT milk decreased with the increase of their shelf life，the contents of proteins was changed with appropriate population. The contents of proteins in milk and milk products were related with their existing form，producing area and processing technology.

high performance capillary electrophoresis(HPCE);milk;milk products;protein

TS252.7

A

1002－0306(2012)08－0108－05

2011－05－17 *通讯联系人

田兰(1977－)，女，硕士，讲师，研究方向:食品药品质量控制与评价。

新疆维吾尔自治区高校科研计划青年教师启动基金(XJMEDU20082008S39)。