超声热浸-紫外分光光度法测定蜂巢蜜中总黄酮含量

江津津，黎海彬，韩 明，黄建初，王 英

(广州城市职业学院建筑环境与食品工程学院，广东广州510405)

超声热浸-紫外分光光度法测定蜂巢蜜中总黄酮含量

江津津，黎海彬，韩 明，黄建初，王 英

(广州城市职业学院建筑环境与食品工程学院，广东广州510405)

建立了一种快速提取测定蜂巢蜜中总黄酮含量的方法—超声热浸紫外分光光度法。蜂巢蜜、蜂胶、蜂皇浆、椴树蜜的超声热浸提取液用聚酰胺柱层析去除杂质干扰后，用分光光度法在360nm波长处测定总黄酮含量。此方法回收率均在90%以上，变异系数均低于2%，具有良好的准确度。与传统方法相比，该方法具有试剂用量少，操作简单等优点，蜂巢蜜中总黄酮含量为14.97mg/100g，虽仅为蜂胶产品总黄酮含量的0.87%，但与其它蜂产品进行比较，总黄酮含量至少高出蜂王浆、洋槐蜜、椴树蜜一倍。蜂巢蜜作为一种新面市的保健食品，在黄酮类活性物质含量上表现出更高的保健价值。

蜂巢蜜，总黄酮，超声热浸提

1.1 材料与设备

蜂巢蜜、洋槐蜜、椴树蜜、蜂胶、蜂王浆 广东养生源蜂业有限公司;甲醇，苯(分析纯)，超纯水，芦丁(生化试剂，≥99%)。

YJ－3200 DTD型超声清洗仪、ALC－210.4型电子分析天平、恒温水浴锅、层析柱 广州精科化玻仪器有限公司定制;循环水真空泵 西安常仪仪器设备有限公司;超纯水仪 美国Millipore公司;UV1100型紫外－可见分光光度计，JJ－2型高速组织捣碎机。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 原料除杂后置冰箱，于0～6℃冷藏后取出，立即粉碎，备用。

1.2.2 芦丁标准溶液配制 取5.0mg芦丁，加甲醇溶解并定容至100mL，即得浓度为50μg/mL芦丁标准储备液。

1.2.3 蜂胶与蜂王浆中总黄酮的提取 分别称取蜂胶与蜂王浆样品0.5g和5g置于250mL烧杯中，用甲醇溶解后定容至100mL，充分混匀后倒回250mL烧杯中于40℃下超声提取20min，静置［8］，用移液管吸取上清液1.0mL于玻璃蒸发皿中，加入5.0mL乙醇及1g聚酰胺粉，用玻璃棒混匀吸附，于60℃水浴上挥去甲醇，先吸取10.0mL苯液将蒸发皿上的聚酰胺粉混匀，然后一并转入关闭活塞的层析柱中，再分别吸取5.0mL苯液清洗玻璃蒸发皿，最后也将苯液和残留聚酰胺粉一并转入层析柱中，20mL苯液分3次完成。15min后开启层析柱活塞，弃去苯液并关闭层析柱活塞，取下平底烧瓶，将25mL容量瓶装于层析柱下方。吸取20mL甲醇，分3次清洗玻璃蒸发皿，再将甲醇转入层析柱中，15min后开启层析柱活塞将黄酮洗脱于25mL容量瓶中，用甲醇定容至25mL。

1.2.4 蜂巢蜜与其他蜂蜜中总黄酮的提取 称量20g粉碎过筛后的蜂蜜，放入250mL烧杯中，加入不同浓度甲醇溶液，放于超声波清洗器内超声提取，设定提取时间，进行四因素三水平的正交实验，以确定最佳超声热浸提参数。将提取液和醇不溶物抽滤分离，用移液管吸取上清液1.0mL于玻璃蒸发皿中，后续柱层析操作与1.2.3中相同。

1.2.5 单因素实验设计 为考察热浸提温度、提取时间、醇浓度、料液比等主要影响因素对样品总黄酮提取的影响。按照表1设计单因素实验。

表1 单因素实验表Table 1 One－factor experimental design

1.2.6 正交实验设计 以黄酮测定含量为考核指标，以影响测定含量的4个因素变量:提取温度(A)、提取时间(B)、甲醇浓度(C)和料液比(D)，设计正交实验因素水平表(表2)，进行L9(34)正交实验，确定超声波提取最佳工艺条件。

表2 正交实验因素水平表Table 2 Orthogonal experimental design

1.2.7 样品中总黄酮含量的测定 标准曲线的制作［5］:精确称取芦丁对照品5.0mg，加甲醇溶解，并定容至100mL，此对照溶液含芦丁对照品50μg/mL。取6个10mL容量瓶，分别准确吸取该芦丁对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL置于10mL容量瓶中，加入甲醇补足至10.0mL，摇匀，放置一刻钟后，置于1cm比色皿中于波长360nm处测定吸光值，绘制标准工作曲线，计算回归方程。

样品测定:将用层析柱洗脱出来的已用甲醇定容至25mL的蜂巢蜜、蜂王浆、洋槐蜜、椴树蜜及蜂胶总黄酮提取液置于1cm比色皿中于波长360nm测定其吸光值，并用标准曲线法定量。

式中:X2:试样中总黄酮的含量(mg/100g);A:由标准曲线算得被测液中黄酮量(μg);V2:试样定容总体积(mL);V1:吸取的上清液体积(mL);M3:试样质量(g)。

2 结果与讨论

2.1 蜂巢蜜甲醇浸提单因素实验结果

在浸提过程中，温度是影响最终提取物黄酮含量的重要因素。甲醇浓度固定为≥95%的条件下，分别在20～40℃温度范围内随着温度的升高，蜂巢蜜中测定的黄酮含量也随之增加。温度≥40℃时对黄酮含量的影响不大，考虑蜂巢蜜中蜂蜡的溶解度和能耗方面的问题，确定提取温度在40℃左右进行。

随着提取时间的延长，测定含量变化缓慢无显著增长，所以总黄酮的提取时间选择在8h内较为合适。

不同料液比对蜂巢蜜进行提取实验结果表明，随着料液比的增大，测定的黄酮含量无明显增大，结合GB/T 24283－2009中的提取方法，采用将1∶10范围内的醇提物直接定容到100mL容量瓶。

在提取时间不超过8h，提取温度恒温在40℃的条件下，料液比1∶10，考察不同醇浓度对测定的黄酮含量变化情况。结果表明随着醇浓度的增加，测定的总黄酮含量也逐渐增大，所以确定提取用甲醇浓度设定在80%以上。

2.2 蜂巢蜜超声热浸提正交实验结果

表3 L9(34)实验结果Table 3 The results of L9(34)tests

由表3的极差R值大小反映出各因素对蜂巢蜜总黄酮提取率大小影响顺序为提取温度＞料液比＞醇浓度＞提取时间，即超声波提取蜂胶过程中，提取温度和料液比为主要影响因素，超声波热浸提蜂巢蜜的最佳工艺应为A1B2C3D1，为进一步确定蜂巢蜜中总黄酮的提取率，对最佳工艺进行验证实验，最后得出最佳工艺参数:提取温度为40℃，甲醇浓度≥95%，料液比为1∶5，超声波提取时间20min，这最佳工艺条件下黄酮提取率为15%，高于表3中出现的任一提取率，说明经过正交实验方案优化得到的提取条件是科学的。超声辅助溶剂热浸提法操作简便，收率高，成本明显较超临界萃取法等其他方法低，操作时间短［7－12］。

2.3 芦丁标准曲线

根据吸光度数据绘制标准曲线，如图2所示，对数据进行直线回归得方程:y=0.0277x－0.0031，R2= 0.9999。本实验选用的测定方法源自国标 GB/T 24283－2009，在国标基础上有所改良［13－15］，所得的标准工作曲线线性良好。所以蜂巢蜜中总黄酮含量的测定以紫外分光光度法为优。

图2 芦丁标准曲线Fig.2 Standard curve of Rutin

2.4 精密度与回收率

随机取同一品种的蜂产品匀浆混匀，做7次平行实验，对其进行误差分析，结果表明各类样品的标准差均≤0.07，变异系数均低于2%，表明实验具有很好的重复性，精密度高。取已知总黄酮含量的样品做回收率实验，分别加入芦丁标准品0.010g和0.020g，加标后的测定值与本底值的差与加标量相比，得到的回收率均≥90%，说明测定方法可靠。

2.5 蜂巢蜜与其他蜂产品中总黄酮含量的比较

实验测得蜂巢蜜中总黄酮含量为14.97mg/100g，与蜂胶总黄酮含量1730.39mg/100g相比有很大差距，仅为蜂胶产品总黄酮含量的0.87%。与洋槐蜜、椴树蜜、蜂王浆进行比较(图3)，则含量明显高于洋槐蜜的4.64mg/100g、蜂王浆的7.67mg/100g和椴树蜜的2.50mg/100g。

图3 不同蜂产品中总黄酮含量比较Fig.3 Contents of total flavone of all samples

3 结论

3.1 本研究采用超声波辅助甲醇热浸提的方式提取蜂产品中的黄酮类化合物，提出了蜂巢蜜中总黄酮提取的新方法。

3.2 本研究根据总黄酮类物质在紫外波长360nm处有最大吸收的原理，与其他检测方法相比，省去用硝酸铝或三氯化铝溶液作显色剂显色的步骤［15－17］，通过在紫外波长360nm处直接测定吸收值并用工作曲线定量来完成测定。针对不同的蜂产品中所含黄酮类物质的差异，提出了总黄酮测定的快捷方法，方法可靠且有创新。

3.3 蜂巢蜜作为一种新面市的保健食品，总黄酮含量比一般蜂蜜和蜂王浆至少多近1倍，在黄酮类活性物质含量上表现出更高的保健价值。

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Ultrasonic sound hot extract－ultraviolet spectrophotometric determination of total flavone in comb honey

JIANG Jin－jin，LI Hai－bin，HAN Ming，HUANG Jian－chu，WANG Ying
(College of Building Environment and Food Engineering，Guangzhou City Polytechnic，Guangzhou 510405，China)

Ultrasonic sound hot extract coupled with ultraviolet spectrophotometric was used to determinatate the total flavone in comb honey.Comb honey，propolis，royal jelly and linden honey were treated with polyamind column chromatography first to remove the impurities，then treated with methanol extract and ultrasonic sound hot extract. The detection method of total flavone was spectrophotometric method performed at 360nm.The mean spike recovery rates of the established method for total flavone in all samples were above 90%with a coefficient of variation of less than 2%.This method displayed excellent precision，had many advantages over the conventional method，such as less reagent consumption and ease of operation.The content of total flavone in comb honey was 14.97mg/100g，It was only 0.87%of that of propolis，but compared with some bee products，the content was nearly doubled.As a new healthy food，comb honey had digher value on total flavone.

comb honey;total flavone;ultrasonic sound hot extract

TS201.2

A

1002－0306(2012)08－0092－03

蜂巢蜜俗称“蜂窝蜜”，是由蜂巢和蜂蜜两部分组成的一种成熟蜜，也称“封盖蜜”。它集蜂胶、蜂王浆、花粉、蜂蜜、蜂蜡等天然营养成分为一体，被誉为蜜中之极品［1－2］。黄酮类化合物被证实具有抗炎症、抗过敏、抗感染、抗肿瘤等功效［3－4］，国家卫生部和食品药品监督管理局将总黄酮作为蜂胶保健食品的标志性成分指标进行检测和鉴定，同时列入产品标准［5－6］。但关于蜂巢蜜中总黄酮的提取与含量测定的研究至今未见报道。

1 材料与方法

2011－06－29

江津津(1977－)，女，博士，讲师，主要从事食品科学方面的研究。

广东省教育部产学研结合项目(2010B090400113);广州市教育系统创新学术团队项目(200915)。