RP-HPLC法测定灵芝胶囊中腺苷

姜丽珍， 胡端龙， 奚静芳， 沈 莹， 张国明

（上海市中药研究所，上海 201401）

灵芝胶囊是由灵芝药材提取的单味制剂，具有宁心安神、健脾和胃的功效。用于失眠健忘、身体虚弱、神经衰弱等症［1］。其质量标准收载于卫生部药品标准“中药成方制剂”第四册，但无定量测定项。2010年版中国药典中，灵芝药材有定量测定项，但其测定对象是以葡萄糖为对照品的紫外-可见分光光度法测定灵芝多糖［2］。显然该方法缺乏专一性，特别是在含有淀粉类辅料的制剂中会引起干扰，且意义不大。为有效控制产品质量，有必要建立特异性更高的定量测定方法。

灵芝中的腺苷是一种活性很强的物质，是近年所发现的有效成分之一，它能提高血液供氧能力和加速血液微循环，提高血液对心脑的供氧能力［3］。灵芝胶囊中腺苷检测近年较多采用高效液相色谱法［4-8］，本实验针对灵芝胶囊品种特点，对流动相选择以及样品前处理等方面作了部分改进，建立了灵芝胶囊高效液相色谱法测定方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，G1365B MWD检测器。

1.2 药品和试剂 腺苷(中国药品生物制品检定所提供，批号879-200202)；样品:灵芝胶囊(上海雷允上药业有限公司提供，批号 100301，100315，100327)；乙腈、甲醇为色谱纯，试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温30℃；流动相乙腈-水(7 ∶93)，检测波长260 nm，体积流量1.0 mL/min，理论塔板数不低于5000。

2.2 对照品溶液的制备 取腺苷对照品适量，精密称定，加15%甲醇制成每1 mL含2 μg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取本品内容物，研细，精密称定约1.5 g，置25 mL量瓶中，加15%甲醇约20 mL，超声15 min，取出，放冷，加15%甲醇至刻度，摇匀，过0.45 m滤膜，取续滤液，即得。

2.4 阴性对照溶液的制备 按工艺处方，制备不含灵芝的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。

2.5 专属性试验 照上述色谱条件，精密量取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪。在腺苷对照品色谱相应的位置上，供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰，且与其它成分的色谱峰分离良好。而阴性液在腺苷保留时间处无色谱峰，不存在干扰(见图1)。

图1 灵芝胶囊中腺苷测定高效液相色谱图

2.6 线性关系的考察 称取腺苷对照品适量，精密称定，加15%的甲醇制成质量浓度为1.9050 μg/mL的对照品溶液，分别精密吸取5、10、20 μL；另15%的甲醇制成质量浓度为16.0000 μg/mL 的对照品溶液，分别精密吸取 5、10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，测得峰面积值。

以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标作标准曲线，得回归方程为Y=3099.1X－7.2753，r=0.9995。结果表明腺苷进样量在0.0095～0.1600 μg范围内与其峰面积呈良好的线性关系。

2.7 精密度试验 精密吸取质量浓度为1.91 μg/mL的腺苷对照品溶液20 μL，按上述色谱条件，重复测定6次，记录峰面积，结果分别为:101.0、102.0、99.44、103.5、100.5、103.1，RSD为1.70%(n=6)，结果表明本试验精密度良好。

2.8 稳定性试验 取批号为100301的样品，按供试品方法制备，按上述色谱条件，于 0、2、4、6、8、10、12 h 进样分析，记录峰面积。结果RSD为1.94%(n=7)，结果表明供试品溶液中含有的腺苷在12 h内稳定。

2.9 重复性试验 取批号为100301的样品，一式6份，按供试品方法制备，按上述色谱条件测定。测定的平均含有量为10.30 μg/粒，RSD 为1.89%(n=6)，结果表明该方法具有较好的重复性。

2.10 回收率试验 取批号为100301的样品适量，一式9份，取0.75 g，精密称定，加入一定量的对照品，按供试品制备方法制备，按上述色谱条件注入液相色谱仪测定，见表1。结果平均回收率为99.60%，RSD为1.28%(n=9)，结果表明该方法稳定可靠。

表1 回收率试验(n=9)

2.11 样品测定 取样品(1) 100301；样品(2) 100315；样品(3)100327，按供试品溶液制备方法制备，按上述色谱条件，精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定，见表2。

表2 样品测定结果(n=3)

3 讨论

报道的高效液相色谱法测定灵芝胶囊中腺苷的流动相，主要采用甲醇或乙腈与磷酸溶液［6］或磷酸二氢钾溶液［5，7］或磷酸缓冲溶液［4，8］组合而成，而本实验采用简单的乙腈-水(7∶93)系统，腺苷分离状况良好，保留时间也适中，更为关键的是它避免了盐类或酸类成分的使用，这对延长分析色谱柱使用寿命有着非常实在的意义。

灵芝胶囊中腺苷含有量较低，每粒在微克量级水平，故在样品前处理方法确定方面，尤其需要重视实验筛选优化。本实验比较了样品回流提取与超声提取效果，发现超声的明显优于回流方法；在提取溶媒选择上，平行比较了15%、50%和90%甲醇的实际提取效果，结果发现15%甲醇提取者含有量高、杂质少、峰形好。

对比现有的灵芝胶囊腺苷测定报道，发现提取溶媒出现多种选择，既有使用 90%甲醇［6，8］的，也有采用水［4］的，甚至还有用流动相［5，7］(甲醇-磷酸二氢钾，10 ∶90)来提取的，对于这种状况，这可能是报道者仅对自己被测的某个具体产品选定溶媒，而实际情况是，不同生产厂家的灵芝胶囊，其所含辅料种类肯定有所不同(部颁标准未对辅料种类作出明确规定)，这就有可能产生上述采用不同溶媒的情况。

灵芝药材的水提取得率不高，必然造成胶囊中含较多量的辅料，这些辅料对微量腺苷测定究竟会产生怎样的影响目前尚不清楚，尽管报道者均作过回收率测定，但根据中药制备过程实际情况，这种回收率并不能完全反映出胶囊制备后大量不同类辅料对微量腺苷所产生的吸附。报道［4］称9家胶囊产品的腺苷量差异很大(每粒12～137 μg)，显然这主要是产品质量高低问题，但也不能排除不同厂家使用不同辅料所产生的测定偏差。

［1］中华人民共和国卫生部药品标准［S］，WS3-B-0753-91.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:174.

［3］陈国良，陈晓清.灵芝有效成分研究综述［J］.中国食用菌，1995，14(4):7-9.

［4］邱文炜，翁雪萍.灵芝胶囊质量标准研究及质量评价［J］.中药材，2005，28(9):827-828.

［5］李开志，雷灼雨，巴国际.RP—HPLC法测定灵芝胶囊中腺苷的含量［J］.中国药房，2007，18(30):2371-2372.

［6］李 军，任孝德，魏晨阳.HPLC法测定灵芝胶囊中腺苷的含量［J］.中医研究，2008，21(9):91-92.

［7］严 华，张聿梅，宋金翠，等.灵芝胶囊中腺苷、腺嘌呤的TCL鉴别及腺苷的HPLC法含量测定［J］.药物分析杂志，2008，28(11):1800-1803.

［8］胡文璐，余 俊，黄宗雯.反相HPLC法测定灵芝胶囊中腺苷的含量［J］.黑龙江医药，2009，22(5):599-601.