HPLC法测定墨旱莲配方颗粒中绿原酸和咖啡酸

周燕园

（桂林医学院，广西 桂林 541004）

墨旱莲为菊科植物鳢肠Eclipta prostrata L.的干燥地上部分，又名旱莲草、鳢肠草、金陵草等，性寒，味甘、酸，入肝、肾经。具有滋肝补肾、凉血止血之功效。主治牙齿松动，须发早白，眩晕耳鸣，腰膝酸软，阴虚血热，吐血，衄血，尿血，血痢，崩漏下血，外伤出血［1-2］。墨旱莲配方颗粒是墨旱莲饮片经水提、浓缩、干燥、制粒等工序制成的单味中药配方颗粒剂，单味中药配方颗粒和传统的水煎剂具有基本相同的有效成分、疗效和药理作用，其性味、归经、功效、成分与原中药饮片基本一致［3-5］。据报道［6-11］，墨旱莲含有三萜类，黄酮类，生物碱类，噻吩类，蟛其菊内酯类，有机酸类等成分，绿原酸和咖啡酸是墨旱莲药材及其中成药制剂中的有效成分，绿原酸具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、免疫调节、降糖等作用，咖啡酸具有抗蛇毒、抗菌、抗病毒、止血等作用。现代药理学研究表明，墨旱莲具有抗肿瘤、免疫调节、抗炎等药理作用与有机酸类成分有一定相关性。而且，2010年版《中国药典》仅有墨旱莲药材和饮片的定量测定，并未对墨旱莲配方颗粒有相应的规定。因此，本实验采用高效液相法［12-13］测定墨旱莲配方颗粒中的绿原酸和咖啡酸，方法简便可行、快速，可用于控制产品质量。

1 仪器及试药

1.1 仪器 Agilent 1100 Series高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)(包括在线脱气、四元泵、柱温箱、自动进样器、二极管阵列检测器、Hp-Chemstation)，Agilent 8453紫外-可见分光光度计(美国安捷伦公司)，BP211D电子分析天平(德国赛多利斯)，Simplicity 185超纯水系统(美国 MILLIPORE公司)，SB3200-T超声清洗器(上海必能信有限公司)，LG16-W离心机(北京医用离心机厂)，SHZ-D循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限公司)，电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂)。

1.2 试药 绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110753-200413，纯度98.7%)，咖啡酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110885-200102，纯度99.1%)，墨旱莲配方颗粒(江阴天江药业有限公司，批号:907222，903055，1003064，规格:每包1 g，相当于10 g药材饮片)，甲醇、乙腈为色谱纯(Fisher公司)，HPLC用水为超纯水，其他试剂为分析纯，均经0.45 μm微孔滤膜滤过后使用。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相甲醇 －0.1%磷酸水溶液(15∶85)；体积流量 1.0 mL/min；检测波长 327 nm；柱温35℃。

图1 混合对照品(A)和墨旱莲配方颗粒样品(B)HPLC图

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸和咖啡酸对照品各8.05、7.37 mg，分别用甲醇定容至25 mL，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取墨旱莲配方颗粒1 g，置具塞锥形瓶中，精密加50%甲醇15 mL，称定质量，超声处理60 min，放冷，补质量，摇匀，滤过，取续滤液，离心，作为供试品溶液。

2.3 供试品处理的正交试验

2.3.1 因素水平的确定 根据墨旱莲配方颗粒活性成分的性质及初步预试验结果，采用L9(34)正交试验安排墨旱莲配方颗粒的提取工艺，以绿原酸和咖啡酸作为评价指标，选择含甲醇量、溶剂体积、超声提取时间3个因素，每个因素设3个水平，因素水平见表1。

表1 提取工艺因素水平

2.3.2 正交试验方法 精密称取墨旱莲配方颗粒1 g于50 mL具塞锥形瓶中，分别按正交因素表制备各样品，称定，提取后取出，冷却后补回原质量，摇匀，滤过，取续滤液，离心，备用。

2.3.3 绿原酸和咖啡酸测定 分别吸取上述各样品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，依法测定绿原酸和咖啡酸的质量分数。结果见表2，方差分析见表3。

2.3.4 最佳提取工艺的确定 由表2可知，比较极差可直观看出，因素C的极差最小，数据处理时作为最小误差项。由表2和表3可知，各因素对提取墨旱莲配方颗粒中绿原酸和咖啡酸的影响程度依次为:A＞B＞C，因素A有显著性差异，即含甲醇量对提取率有显著性影响。因此，对绿原酸和咖啡酸提取的最佳工艺组合为A1B2C3，即选用50%甲醇溶剂15倍量，超声处理60 min。

表2 L9(34)正交试验设计及结果(n=3)

表3 方差分析

2.3.5 验证试验 精密称取同一批号墨旱莲配方颗粒3份(批号:0907222)，每份1 g，按照最佳工艺A1B2C3进行超声提取，并按2.2.2项下方法制备供试品溶液，以2.1项色谱条件精密吸取10 μL进样分析。结果绿原酸和咖啡酸的平均质量分数分别为0.8086、0.2882 mg/g，平均总质量分数为1.0968 mg/g，表明本方法的提取效果较好。

2.4 线性关系考察

精密量取绿原酸标准液1、2.5、5、7.5 mL分别定量至10 mL量瓶，加甲醇溶解并定容至刻度，制成不同质量浓度的对照品溶液，各精密吸取所得质量浓度标准液及原质量浓度标准液10 μL，注入液相色谱仪中，按照上述色谱条件测定峰面积积分值。以绿原酸的质量浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，求得回归方程为Y=31791.7071X+20.897821，r=0.99995，结果表明，绿原酸在0.0322～0.322 mg/mL之间呈良好线性关系。

精密量取咖啡酸标准液0.3、2、4、6、8mL分别定量至10 mL量瓶，加甲醇溶解并定容至刻度，制成不同质量浓度的对照品溶液，各精密吸取所得质量浓度标准液10 μL，注入液相色谱仪中，按照上述色谱条件测定峰面积积分值。以咖啡酸的质量浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，求得回归方程为Y=74105.14X+6.0353423，r=0.99996，结果表明，咖啡酸在0.008844～0.23584 mg/mL之间呈良好线性关系。

2.5 精密度试验 精密量取混合对照品溶液(绿原酸质量浓度:0.0547 mg/mL，咖啡酸质量浓度:0.0191mg/mL)10 μL，按上述2.1项色谱条件，进样，平行测定5次，计算，结果绿原酸、咖啡酸峰面积的RSD值分别为0.74%和0.41%。

2.6 重复性试验 取同一批号供试品6份(批号:0907222)，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，以2.1项色谱条件进样分析，结果绿原酸的平均质量分数为0.8168 mg/g，RSD为1.72%，咖啡酸的平均质量分数为0.2872 mg/g，RSD为1.61%，表明本法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取同一批号供试品(批号:0907222)，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，以2.1项色谱条件分别在0、2、6、12、18、24 h 进样 10 μL，测定绿原酸、咖啡酸峰面积，RSD分别为1.63%、1.52%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 加样回收试验 取同一批(批号:0907222)已知量的供试品6份，每份约0.5 g，精密称定，分别精密加入对照品的50%甲醇溶液(绿原酸质量浓度为0.082 mg/mL，咖啡酸质量浓度为0.028 mg/mL)5 mL，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，以2.1项色谱条件进样，测定绿原酸、咖啡酸。结果绿原酸的平均回收率为101.60%，RSD为1.94%，咖啡酸的平均回收率为102.62%，RSD为1.27%，表明本法准确度较好。见表4。

2.9 不同批号样品的测定 按2.2.2项下方法和2.1项色谱条件，对3批的墨旱莲配方颗粒进行分析，结果见表5。

表4 加样回收率测定结果(n=6)

表5 样品中绿原酸和咖啡酸测定结果(n=3)

3 讨论

采用正交试验法对样品的提取条件进行了优化，确定了采用50%甲醇15倍量为提取溶液，超声提取60 min的样品前处理方法。

流动相的pH对分离有较大的影响，因为绿原酸、咖啡酸具有羧酸结构，呈酸性，以甲醇-水(15∶85)为流动相时拖尾较严重，改用甲醇－0.1%磷酸溶液(15∶85)，结果供试品色谱中绿原酸和咖啡酸得到了良好的分离。

用二极管阵列检测器分析比较了绿原酸和咖啡酸对照品色谱峰和样品中所测成分相应色谱峰的紫外吸收光谱，绿原酸、咖啡酸在327 nm波长下均有较强吸收，与文献［12-13］报道相同，并且检测灵敏度较高，对同时测定绿原酸和咖啡酸较为适宜，因此选用327 nm波长检测。

不同批号样品测定结果表明，同一厂家不同批号墨旱莲配方颗粒中指标成分绿原酸和咖啡酸存在一定差异，这可能与墨旱莲的采收季节，来源及加工过程有关。而色谱图中的其他成分有待进一步研究，以便为墨旱莲配方颗粒制定较全面的质量控制标准提供科学依据。

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