甘氨酸对烧伤大鼠心肌细胞能量代谢的影响＊

李 腾，彭 靖，吕尚军，吴 炜，张 勇，徐淑秀△，彭 曦▲

（1.蚌埠医学院护理系，安徽蚌埠233030；2.第三军医大学西南医院全军烧伤研究所/创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆400038）

甘氨酸对烧伤大鼠心肌细胞能量代谢的影响＊

李 腾1，彭 靖1，吕尚军2，吴 炜2，张 勇2，徐淑秀1△，彭 曦2▲

（1.蚌埠医学院护理系，安徽蚌埠233030；2.第三军医大学西南医院全军烧伤研究所/创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆400038）

目的探讨甘氨酸对烧伤后大鼠心肌细胞能量代谢的影响。方法将72只Wistar大鼠随机分成正常对照组（C组）、烧伤对照组（B组）、甘氨酸组（Gly组）。B、Gly组建立30%体表面积Ⅲ度烧伤大鼠模型，观察伤前及烧伤后12、24、48、72h大鼠心肌细胞能量代谢的变化，同时检测伤后高能磷酸化合物（AMP、ADP和ATP）、血浆乳酸和谷胱甘肽（GSH）的水平。结果烧伤大鼠心肌能量代谢发生障碍，与C组相比，B组和Gly组大鼠心肌ATP及GSH水平大幅下降（P＜0.01），而AMP、ADP、血乳酸水平则大幅上升（P＜0.01）；Gly组大鼠心肌ATP、GSH下降以及AMP、ADP、血乳酸上升幅度均明显低于B组（P＜0.01）。结论甘氨酸能改善烧伤后心肌有氧代谢，减少乳酸生成，有效降低烧伤后心肌受损程度，具有很好的心肌保护作用。

甘氨酸；心肌；烧伤；能量代谢；大鼠

在严重烧伤或心肌缺血、缺氧时，心脏作为全身血液循环的动力器官，心肌的损伤和功能减退必将进一步加重全身的缺血、缺氧，造成有氧代谢障碍，乳酸代谢产物堆集，产生大量活性自由基，从而导致细胞损伤，形成恶性循环。为此，针对心肌能量代谢障碍的治疗是减轻烧伤后心肌损害的重要措施。近年来研究发现，游离的甘氨酸具有显著的组织、细胞保护作用［1］。它通过激活突触后膜上的甘氨酸受体来发挥作用，甘氨酸与其受体结合后，导致心肌细胞膜去极化明显减轻，使细胞膜电压依赖性钙离子通道开放减少，钙离子内流减少，从而起到细胞保护作用［2－4］。但鲜见甘氨酸对烧伤后心肌能量代谢影响的报道。本研究拟观察甘氨酸对烧伤大鼠心肌能量代谢的影响，以及为临床合理使用甘氨酸奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物模型

1.1.1 烧伤模型的制作及分组 健康成年 Wistar大鼠72只，体质量（210±20）g，雌雄不拘（由第三军医大学实验动物中心提供）。随即分成3组，正常对照组（C组）、烧伤对照组（B组）、甘氨酸组（Gly组）。C组8只大鼠，其他各组每个时相点各8只大鼠。C组大鼠不予烧伤，其他2组大鼠烧伤前禁食12 h，1%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔注射麻醉，背部电推剃毛后8%硫化钠脱毛，3%固体汽油烧伤15s。伤后立即腹腔注射50mL/kg的乳酸林格氏液抗休克。创面涂2%聚维酮碘抗感染，每天2次，伤后给予标准动物颗粒饲料喂养，自由饮水。

1.1.2 时相设置和给药剂量 实验分烧伤后12、24、48、72h 4个时相点。伤后Gly组腹腔注射给予甘氨酸（0.5g·kg－1·d－1），B组腹腔注射等体积生理盐水。

1.2 检测指标

1.2.1 心肌组织高能磷酸化合物的检测 取左心室立即用在液氮中预冷的金属夹板将心肌组织夹成冷冻薄片，迅速称取100mg心肌组织，加入预冷的0.42mol/L高氯酸制成匀浆，再加入1mol/L氢氧化钾中和，然后用超声波细胞粉碎器将线粒体膜打碎，使能量物质全部释放于溶液中（以上操作过程均在冰水中进行）。然后3 000r/min离心15min，上清液用0.2 m微孔滤膜过滤，取10L滤液HPLC上柱分析AMP、ADP、ATP。蛋白浓度的测定方法及步骤同前。能荷（energy charge，EC）＝（ATP＋1/2ADP）÷ （ATP＋ADP＋AMP）。

1.2.2 心肌组织谷胱甘肽（GSH）的检测 断颈处死大鼠，立即剖胸取出心脏，剪取右心室心尖区部位组织，匀浆。按试剂盒说明书操作，比色法测定GSH水平。GSH水平（mg/g）＝（测定管吸光度值－空白管吸光度值）÷（标准管吸光度值－空白管吸光度值）×标准管浓度（0.5mmol/L）×GSH相对分子质量÷组织蛋白水平（g/L）。其中组织蛋白水平测定参照BCA法。

1.2.3 全血乳酸变化的检测 各组各时相点麻醉大鼠从插管导管中取血，每组取0.1mL置入抗凝管中并加入0.6mL蛋白沉淀剂，轻轻颠倒混匀，静置10min后，3 500～4 000r/min离心8min，取上清液进行测定。按照说明书提供的操作方法，测定全血乳酸的水平。乳酸水平（mmol/L）＝（测定管吸光度值－空白管吸光度值）÷（标准管吸光度值－空白管吸光度值）×标准浓度×样本稀释倍数（标准浓度＝3mmol/L，样本稀释倍数＝7倍）。

1.3 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，组间比较采用多因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组大鼠心肌组织高能磷酸化合物（AMP、ADP和ATP）水平的变化情况 B、Gly组心肌组织中的ATP和EC均开始下降，相同时相点明显低于C组（P＜0.01）；AMP和ADP在烧伤后均上升，相同时相点明显高于C组（P＜0.01）；Gly组各项指标于相同时相点较B组变化程度小，Gly组于12h作用明显（P＜0.05），见表1～4。

2.2 3组大鼠心肌组织GSH水平的变化情况 烧伤后GSH迅速消耗，B组随时相持续下降，72h达最低（P＜0.01）；Gly组GSH的下降程度明显缓慢（P＜0.05），见表5。

2.3 3组大鼠心肌组织全血乳酸水平的变化情况 烧伤后全血乳酸迅速上升，24h达最高，随即开始下降（P＜0.01）；Gly组随时相持续上升，24h达最高，水平低于同时相B组（P＜0.05）。见表6。

表1 3组大鼠不同时相点烧伤后AMP水平的变化（μmol/g±s，n＝8）

表1 3组大鼠不同时相点烧伤后AMP水平的变化（μmol/g±s，n＝8）

－：表示无数据；a：P＜0.01，与C组比较；b：P＜0.05，c：P＜0.01，与B组同时相点比较。

0h 12h 24h 48h 72h B组 － 0.98±0.08a0.89±0.01a0.90±0.06a0.81±0.08组别a Gly组 － 1.11±0.05ac0.97±0.03ab0.99±0.08ac0.90±0.04acC组0.81±0.0

表2 3组大鼠不同时相点烧伤后ADP水平的变化（μmol/g±s，n＝8）

表2 3组大鼠不同时相点烧伤后ADP水平的变化（μmol/g±s，n＝8）

－：表示无数据；a：P＜0.01，与C组比较；b：P＜0.05，c：P＜0.01，与B组同时相点比较。

0h 12h 24h 48h 72h B组 － 0.66±0.64a0.55±0.49a组别0.48±0.29 0.47±0.27 Gly组 － 0.63±0.68ab0.61±0.59ab0.58±0.44ac0.53±0.38acC组0.43±0.2

表3 3组大鼠不同时相点烧伤后ATP水平的变化（μmol/g±s，n＝8）

表3 3组大鼠不同时相点烧伤后ATP水平的变化（μmol/g±s，n＝8）

－：表示无数据；a：P＜0.01，与C组比较；b：P＜0.05，c：P＜0.01，与B组同时相点比较。

0h 12h 24h 48h 72h B组 － 2.28±0.25a2.04±0.07a1.79±0.07a1.71±0.14组别a Gly组 － 2.46±0.29ab2.39±0.08ab2.11±0.10ac2.07±0.10acC组2.53

表4 3组大鼠不同时相点烧伤后EC水平的变化（±s，n＝8）

表4 3组大鼠不同时相点烧伤后EC水平的变化（±s，n＝8）

－：表示无数据；a：P＜0.01，与C组比较；b：P＜0.05，c：P＜0.01，与B组同时相点比较。

0h 12h 24h 48h 72h B组 － 0.52±0.04a0.43±0.02a0.18±0.01a0.33±0.04组别a Gly组 － 0.48±0.05ab0.50±0.02ac0.40±0.04ac0.42±0.02acC组0.55±0.04

表5 3组大鼠不同时相点烧伤后GSH水平的变化（μmol/g±s，n＝8）

表5 3组大鼠不同时相点烧伤后GSH水平的变化（μmol/g±s，n＝8）

－：表示无数据；a：P＜0.01，与C组比较；b：P＜0.05，c：P＜0.01，与B组同时相点比较。

0h 12h 24h 48h 72h B组 － 60.50±4.20a57.80±0.48a54.90±2.20a54.90±2.20组别a Gly组 － 66.80±7.95ab66.70±0.90ab58.90±1.23ac58.40±0.71abC组72.3

表6 3组大鼠不同时相点烧伤后全血乳酸水平的变化（μmol/g±s，n＝8）

表6 3组大鼠不同时相点烧伤后全血乳酸水平的变化（μmol/g±s，n＝8）

－：表示无数据；a：P＜0.01，与C组比较；b：P＜0.05，c：P＜0.01，与B组同时相点比较。

0h 12h 24h 48h 72h B组 － 5.73±0.26a6.22±0.32a5.81±0.29a5.31±0.43组别a Gly组 － 5.24±0.29ac5.71±0.18ab5.45±0.30ac5.28±0.36aC组4.4－

3 讨 论

心肌缺血、缺氧性损伤常导致细胞能量代谢障碍，不仅可引起心肌细胞内环境紊乱，还能引起心肌收缩能力下降［5－6］。烧伤早期存在心肌缺血、缺氧性损害，导致心功能不全，还可诱发或加重休克，以及全身其他组织器官的缺血、缺氧损害和炎症反应［7－8］。故改善烧伤早期心肌能量代谢障碍逐渐成为研究热点。严重烧伤后，心肌血液灌流不足，使心肌细胞缺氧、缺乏能量底物和氧化磷酸化过程中所需的各种基质，线粒体内有氧氧化过程障碍，结果使ATP生成减少，导致心肌组织中高能磷酸化合物水平下降。实验结果表明，烧伤后心肌组织ATP水平和EC均明显低于伤前，并呈现进行性下降的趋势，伤后72 h降至谷底。甘氨酸在体内不是直接的能源物质，在心肌细胞内也不参与转氨基作用，但可作为一碳单位的来源参与能量代谢过程。因此，烧伤后及时给予作为机体能量代谢重要底物的甘氨酸对改善心肌细胞能量代谢具有重要意义。

甘氨酸能改善心肌细胞能量合成方式。烧伤后心肌组织营养血供大幅降低，导致细胞处于乏氧状态，此时细胞能量代谢以有氧代谢为主转为以无氧酵解为主。无氧酵解时，能量底物利用率大幅下降。尽管无氧酵解在短时间内提供一定量的ATP，但如果细胞长时间处于无氧酵解状态，不仅无法满足细胞的能量需求，还会由于代谢产物乳酸的堆积，造成细胞进一步损伤。实验结果显示，烧伤后血乳酸水平迅速上升，24h即达峰值，但明显低于B组，说明烧伤后机体能量代谢中无氧酵解迅速增加，能量合成障碍。给予甘氨酸后乳酸峰值仍出现在24h，但明显低于B组，同时ATP明显增加，提示使用甘氨酸后能改善机体能量合成方式，降低对无氧酵解的依赖，纠正乳酸堆积，增加能量合成。

烧伤后由于心肌血流灌注不足导致心肌缺血、缺氧，再灌注时心肌组织产生大量的活性自由基可以直接攻击线粒体蛋白巯基，影响线粒体氧化代谢的3个关键酶及电子传递链中酶的活性，导致烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）减少，ATP合成障碍［9］。GSH是机体重要的自由基清除剂，它是由g－羧基与半胱氨酸及甘氨酸在体内合成的三肽，甘氨酸是其组成成分之一。实验结果显示，烧伤后心肌组织中GSH水平迅速下降，说明烧伤后GSH合成减少或生成的大量自由基导致GSH耗竭。给予甘氨酸，心肌组织GSH下降程度明显低于B组。在烧伤后12、24h与伤前差异无统计学意义。GSH对自由基的清除减轻了线粒体脂质过氧化损害，维护了细胞正常的代谢功能［10］。

综上所述，甘氨酸能够作为一碳单位的来源参与能量代谢过程，改善能量合成方式，促进抗氧化物质GSH的合成，减少自由基的产生，纠正乳酸堆积，减轻细胞损伤。其还能维护心肌细胞线粒体膜稳定性，减轻多种致伤因素导致的心肌损害［11］，但甘氨酸改善烧伤后心肌细胞能量代谢的作用机制还需进一步探讨。

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Effects of glycine on energy metabolism of myocardium after burn injury＊

LiTeng1，PengJing1，LvShangjun2，WuWei2，ZhangYong2，XuShuxiu1△，PengXi2▲
（DepartmentofNursing，BengbuMedicalCollege，Bengbu，Anhui233030，China；2.InstituteofBurnResearch，SouthwesternHospital，StatekeyLaboratoryofTrauma，BurnsandCombinedInjury，ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400038，China）

ObjectiveTo discuss the effects of glycine on energy metabolism of myocardium after burn injury.MethodsThe rat model of 30%body surface area third degree burn was adopted.72Wistar rats were randomly divided into three groups：normal control（C），burn control（B）and glycine treatment（Gly）groups.Resting energy metabolism of myocardium，the level of high－energy phosphate compound（AMP，ADP，ATP），lactic acid and glutathione（GSH）were determined before burn and on post－burn 12，24，48，72hours.ResultsAfter burn injury，energy metabolism of myocardium had notable disorder.Compared with group C，the levels of ATP and GSH in group B and Gly were obviously decreased（P＜0.01），while the levels of AMP，ADP and lactic acid were significantly increased（P＜0.01）.Both the declining range of ATP，GSH and the rising range of AMP，ADP and lactic acid in group Gly were remarkably lower than those in group B（P＜0.01）.ConclusionGlycine administration could improve aerobic metabolism of myocardium after burn injury，reduce the count of lactic acid，abate the degree of cardiac injury after burn injury，and possess protection of myocardium.

glycine；myocardium；burns；energy metabolism；rats

10.3969/j.issn.1671－8348.2012.33.005

A

1671－8348（2012）33－3476－03

国家重点基础研究发展计划资助项目（973计划，2005CB522601）；第三军医大学临床创新基金（2009XLC10）。△ 通讯作者，Tel：13955233526；E－mail：xxssxx53＠sina.com。▲ 通讯作者，Tel：13983402384；E－mail：pxlrmm＠163.com。

2012－02－16

2012－07－22）