两种方法提取林蛙籽脂肪酸的气-质联用分析

李铁纯，侯冬岩，刁全平，孙 博，回瑞华

(鞍山师范学院化学系，辽宁 鞍山 114007)

两种方法提取林蛙籽脂肪酸的气-质联用分析

李铁纯，侯冬岩，刁全平，孙 博，回瑞华

(鞍山师范学院化学系，辽宁 鞍山 114007)

采用Bligh-Dyer提取法和Soxhlet提取法分别提取林蛙籽中的脂肪油，再进行甲酯化处理，利用气相色谱-质谱联用仪进行分析。Bligh-Dyer法提取的脂肪油中检测出27种脂肪酸，其中不饱和脂肪酸为16种，相对含量72.49%，二十碳四烯酸甲酯和二十碳五烯酸均为5.72%，二十二碳六烯酸为5.02%，亚油酸为8.89%，二十二碳六烯酸甲酯为5.72%。Soxhlet法提取的脂肪油中检测出12种脂肪酸，其中不饱和脂肪酸6种，相对含量64.86%，油酸为21.99%，亚油酸为7.58%，二十碳五烯酸为5.22%。

林蛙籽；脂肪酸；气相色谱-质谱

林蛙(Rana chensinensis)俗称田鸡、哈士蟆等[1]，是一种经济价值极高的两栖动物，广泛分布于我国东北三省。林蛙属于药、食两用的珍贵蛙种，林蛙的蛙籽具有很高的营养价值，可用于制药和保健食品，具有调节免疫、延缓衰老、壮阳、明目、调节血脂和预防妇女更年期综合症的作用[2]。近年来，对林蛙籽营养成分中的甾类激素、氨基酸、微量元素[3-4]等有报道，而关于林蛙籽脂肪酸的研究少见报道。本实验采用Bligh-Dyer提取方法和Soxhlet提取法分别对林蛙籽的脂肪油进行提取[5-7]，进行甲酯化处理，利用气相色谱-质谱联用法(gas chromatography-mass spectrometry，GCMS)对其进行分析测定[8]，分离鉴定其中的脂肪酸成分，为更好地开发和利用林蛙籽提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

林蛙采自抚顺林蛙养殖场。

石油醚、正己烷、甲醇、氢氧化钠、氯仿均为分析纯。

HP6890GC/5973MS型气相色谱-质谱联用仪 美国惠普公司；80-2B台式离心机 上海安亭科学仪器厂；RE-52C旋转蒸发器 上海亚荣盛华仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

将林蛙清洗后自然晾干，解剖取出蛙籽，干燥，研碎后备用。

1.2.2 Bligh-Dyer法提取脂肪油

称取5.00g经1.2.1节方法处理的蛙籽，放入250mL锥形瓶中，加入100mL甲醇，50mL氯仿，40mL蒸馏水，电磁搅拌10h放置过夜后，加入50mL氯仿，50mL蒸馏水，过滤后分液取下层有机相，旋转蒸发回收氯仿，得油率为30.8%。

1.2.3 Soxhlet提取法提取脂肪油

称取5.00g经1.2.1节方法处理的蛙籽，放入滤纸筒中，再装入索氏提取器中，加入100mL的石油醚，恒温水浴70℃回流萃取5h，旋转蒸发回收石油醚，得油率为32.4%。

1.2.4 脂肪油的甲酯化

分别将提取的脂肪油加入8.0mL正己烷，再加入4.0mL氢氧化钠-甲醇溶液液(0.5mol/L)，置水浴上70℃回流20min，取出冷却移至刻度试管中，再加水10mL，超声提取、离心、取上层清液，待做GC-MC分析。

1.2.5 GC-MC条件

色谱条件：色谱柱为弹性石英毛细管HP-5(25m× 0.20mm，0.33μm)；进样口温度：300℃；程序升温：初始温度100℃然后以10℃/min速率升温至280℃(保持10min)；分流比：50:1；进样量：0.4μL；载气流量：1mL/min。

质谱条件：电子离子源、离子源温度230℃、电离电压70eV、电子倍增器电压1988V、发射电流34.6μA、接口温度150℃、质量范围为20～500m/z。

1.2.6 测定方法

取经1.2.4节方法处理过的样品0.4μL，用GC-MS进行分析鉴定，通过G1701BA化学工作站数据处理系统，检索NIST 98谱图库，并分别与八峰索引及EPA/ NIH质谱图集的标准谱图进行对照[9]，确定样品中各个化学成分。通过G1701BA化学工作站数据处理系统，按峰面积归一化法进行定量分析，分别求得各化学成分的相对含量。

2 结果与分析

表1 林蛙籽脂肪酸甲酯的组成及相对百分含量Table 1 Fatty acid methyl esters and relative contents in eggs of R. chensinensis

样品经过GC-MS分析鉴定，得到林蛙籽脂肪酸甲酯的总离子流图(图1)。确认的样品中脂肪酸甲酯成分及相对含量见表1。

表1表明，Bligh-Dyer法提取的林蛙籽脂肪油中共检测出27种脂肪酸，其中不饱和脂肪酸16种，相对含量72.49%，二十碳四烯酸甲酯和二十碳五烯酸均为5.72%，二十二碳六烯酸为5.02%，亚油酸为8.89%，还检测出二十二碳六烯酸甲酯为5.72%。Soxhlet法提取的脂肪油中检测出12种脂肪酸，其中不饱和脂肪酸6种，相对含量64.86%，油酸为21.99%，亚油酸为7.58%，二十碳五烯酸为5.22%。

图1 Bligh-Dyer法(A)和索式提取法(B)处理林蛙籽脂肪酸甲酯总离子流图Fig.1 TIC of fatty acid methyl ester in eggs of R. chensinensis by Bligh-Dyer (A) and soxhle (B)

3 讨 论

Bligh-Dyer法提取脂肪油得油率为30.8%，Soxhlet提取法提取脂肪油得油率为32.4%，Soxhlet提取法略高于Bligh-Dyer法提取脂肪油的得油率。Bligh-Dyer法提取的林蛙籽脂肪油中共检测出27种脂肪酸，不饱和脂肪酸16种；Soxhlet提取法提取的脂肪油中检测出12种脂肪酸，不饱和脂肪酸6种。说明Bligh-Dyer法提取的林蛙籽脂肪油中所含有的脂肪酸不仅种类多于Soxhlet提取法，而且不饱和脂肪酸相对含量较高于Soxhlet提取法，其主要原因是：采用Soxhlet提取法，在加热条件下不饱和脂肪酸特别是多不饱和脂肪酸化学性质不稳定，容易被氧化。采用Bligh-Dyer法，在室温条件下进行提取，避免了脂肪酸在提取过程中的损失。

Bligh-Dyer法提取的林蛙籽脂肪油中检测出二十碳五烯酸(EPA)为5.72%，二十二碳六烯酸(DHA)为5.02%，Soxhlet提取法提取的林蛙籽脂肪油中只检测出EPA为5.22%，而未检测出DHA。EPA和DHA具有不同的生理活性，不同人对EPA和DHA的食用是有选择性的，以健脑益智恢复视力为目的需要补充较多的DHA，以促进心脑血管循环为目的需要补充较多的EPA。

两种方法提取的林蛙籽脂肪油中不饱和脂肪酸含量均较高，研究表明，多不饱和脂肪酸具有降低胆固醇、降低血液黏稠度、改善血液微循环、提高脑细胞的活性、增强记忆力和思维能力，对心脑血管疾病起到预防作用[10-15]。本实验为林蛙籽的进一步开发提供一定的科学依据。

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Analysis of Fatty Acids inRana chensinensisEggs by Two Different Extraction Methods Combined with GC-MS

LI Tie-chun，HOU Dong-yan，DIAO Quan-ping，SUN Bo，HUI Rui-hua
(Department of Chemistry, Anshan Normal University, Anshan 114007, China)

The egg oil ofRana chensinensiswas extracted by Bligh-Dyer method or Soxhlet extraction method, methyl esterfied, and then analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). A total of 27 fatty acids were identified in the egg oil obtained by Bligh-Dyer method, including 16 unsaturated fatty acids (72.49%), such as arachidonic acid methyl ester (5.72%), eicosapentaenoic acid (5.72%), docosahexaenoic acid (5.02%), 9,12-octadecadienoic acid (8.89%), and 5,8,11,14-eicosatetraenoic acid (5.72%). Twelve fatty acids were identified by Soxhlet extraction method combined with GC-MS, comprising 6 unsaturated fatty acids (64.86%), such as 9-octadecenoic acid (21.99%), 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid (7.58%) and 9,12-octadecadienoic acid (5.22%).

Rana chensinensiseggs；fatty acid；gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

O657.63

A

1002-6630(2012)18-0195-03

2011-06-23

辽宁省教育厅科学技术基金项目(20331079)

李铁纯(1969—)，男，教授，博士，主要从事有机分析及天然产物化学研究。E-mail：tiechunli@163.com