绿色木霉菌发酵液对芒果采后病害及品质的影响

叶伟娟，冯卫华，于 新,*，吴少辉，蒋 雨

(1.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东 广州 510225；2.四川农业大学食品学院，四川 成都 611130)

绿色木霉菌发酵液对芒果采后病害及品质的影响

叶伟娟1，冯卫华1，于 新1,*，吴少辉1，蒋 雨2

(1.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东 广州 510225；2.四川农业大学食品学院，四川 成都 611130)

研究木霉菌发酵液对控制芒果采后病害及腐烂的作用。以紫花芒果果实为材料，使用绿色木霉菌(Trichoderma viridePers.ex Fr.)发酵液涂抹果实，于(30±5)℃、相对湿度90%～95%贮藏，测定果实病斑数及面积、硬度和色泽指数。结果表明：紫花芒果贮藏至第9天，T. viride发酵液处理组腐烂指数仅为31.1%，对照组腐烂指数则达51.9%；损伤接种至7d时，T. viride发酵液处理组的病斑面积比对照组的小69.7%；贮藏至30d，T. viride发酵液处理的芒果自然发病率较清水处理组的低36.7%。T. viride发酵液处理组的芒果在贮藏6d后变软，比对照组延缓了3d。T. viride发酵液混合CMC处理的果实转黄速度较对照组延缓了3d。T. viride发酵液可显著减低损伤接种芒果的腐烂指数、病斑面积和接种发病率。

绿色木霉菌；发酵液；芒果炭疽菌；病害；品质

芒果(Mangifera indicaLinn)属漆树科植物，为热带地区广为种植的一种呼吸跃变型水果。我国盛产芒果的地区主要有海南、广东、广西、云南、四川等地。炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioidesP. Henn)是芒果采后贮藏过程中影响最大的病原菌之一[1]，具有潜伏侵染特性[2-3]， 贮运期间引起的芒果发病率可达30%～50%，造成巨大的经济损失。目前，多采用农药、杀菌剂、防腐剂等化学方法进行芒果采后病害防治，但都存在一定食品隐患。因此，无毒、无污染、高效的天然果蔬保鲜剂的研究与开发越来越受到研究人员重视。

绿色木霉菌(Trichoderma viridePers.ex Fr.)能够代谢产生多种具有抗生活性的物质[4-6]，如水解酶类、多肽类、萜类、抗生类物质等，在植物病害生防中起重要的作用[7-8]，但未见其发酵液用于防治果蔬采后病害。在前期体外研究T.viride发酵液对芒果炭疽菌抑制作用的基础上[9]，本实验将T.viride发酵液应用于芒果采后处理，研究其采后病害的防治效果及其对芒果贮藏品质的影响，为探讨以T.viride发酵液替代化学杀菌剂防治芒果采后病害提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫花芒(Mangifera indicaL. cv. Zihua)，2010年6月采于广州市番禺区仲恺农业工程学院农场，选择果实硬度均值大于15kg/cm2，果面为绿色，大小、成熟度一致的芒果进行试验；T. viride广东省微生物菌种保藏中心；C. gloeosporioides仲恺农业工程学院微生物实验室。

马铃薯葡萄糖(PDA)培养基：液体培养基优化配方为质量分数77%水、20%土豆、2%葡萄糖、1%玉米粉、1‰聚山梨酯，pH9，培养基经121℃灭菌30min，备用。

1.2 仪器与设备

FA1004电子天平 德国Sartorial公司；PHS-25型酸度计 上海伟业仪器厂；DHZ-DA摇床 太仓市实验设备厂；SYQ-DSX-280B灭菌锅 上海申安医疗器械厂；SW-CJ-IF型无菌超净工作台 苏州净化设备有限公司；LRH-250A 型生化培养箱 广东省医疗器械厂；R201D-II型旋转蒸发仪 无锡星海王生化设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1T. viride发酵液制备

T. viride活化培养72h，加无菌水制成108CFU/mL菌悬液，备用。于250mL锥形瓶分别装入50mL液体培养基、150μLT. viride菌悬液，置32.5℃、120r/min恒温摇床发酵7d。发酵完成后，过滤除去菌丝，转入无菌离心管中4℃、6000r/min离心15min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤。分别旋转蒸发浓缩至原体积的1/2、1/4、1/8，置于4℃冷藏备用。

1.3.2 芒果接种发病率测定

将28℃培养10d的C. gloeosporioides用无菌水配制成孢子悬浮液。用血球计数板，将孢子浓度调至1× 106个孢子/mL，备用。芒果采收后，剔除病、伤果。选择果实硬度均值大于15kg/cm2，果面为绿色、大小、成熟度一致的芒果。分别用70%酒精和无菌水擦拭果实表面进行清洁，然后用注射器注射芒果炭疽菌孢子悬浮液，每果接种5个[10]。

用无菌棉蘸T. viride发酵液覆盖接种点1min，共3次，然后自然晾干。以无菌水处理的芒果为对照。每组处理50个芒果，重复3次，室温(30±5)℃、90%～95%相对湿度(relative humidity，RH)条件贮藏。每天观察芒果发病率，利用十字交叉法测量病斑直径(d)。分别取芒果病斑外2cm周围的果肉和远离病斑的健康组织果肉待测各指标。

1.3.3 芒果自然发病率测定

CMC黏度高、延展性强，有利于T. viride浓缩发酵液均匀地粘附在芒果表面，本实验添加CMC作为成膜剂。用清水清洗芒果，晾干分为3组，每组50只。采用浸涂法处理，分别用 0.05g/mL CMC溶液、含10% (V/V)T. viride浓缩发酵液的羧甲基纤维素(CMC)溶液(质量浓度0.05g/mL)进行浸涂处理，另一组不处理为对照组。贮藏过程中记录发病及病斑情况，自然发病率计算公式如下[12]：

结合本实验芒果大小及接种的点数等因素综合进行分级[13]：0级：未发病；1级：病斑面积＜2cm2；2级：病斑面积＜8cm2；3级：病斑面积＜14cm2；4级：病斑面积＞14cm2。

1.3.4T. viride发酵液浓度对芒果果实腐烂面积的影响

80只芒果清洗后分4组进行损伤接种，分别用浓缩倍数为2、4、8倍的T. viride发酵液处理，以无菌水处理为对照组，每天观察病斑大小。

1.3.5 芒果果实硬度测定

围绕果实腰部，各取4个点，削去果皮，用GY-1型硬度计测定果实硬度[14]。每个处理每次测定3个果实，重复3次。

1.3.6 芒果色泽指数测定

观察每个处理的芒果果实果皮色泽变化。果皮颜色评价的色泽分为：0级：全绿；1级：果蒂转黄；2级：果面＜25%转黄；3级：果面25%～50%转黄；4级：果面50%～75%转黄；5级：全部转黄[15-16]。色泽指数计算公式如下：

1.3.7 数据统计与分析

Excel 2003统计分析数据，每项个测定均重复3次，结果表示为平均值±标准差。应用SPSS 10.0软件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)对数据进行方差分析，并利用邓肯氏(Duncan)多重比较进行差异显著性分析。P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1T. viride发酵液对芒果果实腐烂及病斑面积的影响

接种芒果炭疽菌后，随着贮藏时间的延长，芒果果实开始发病，并且病斑面积不断扩大，如图1A所示。与对照相比，用T.viride发酵液处理的芒果感染C.gloeosporioides的腐烂指数(图1B)和病斑面积同期较小。在前6d，腐烂情况都较轻，腐烂指数均小于10%。到第7天，对照组腐烂指数陡然增加，至26.1%，处理组仅为10.3%。第9天，对照组腐烂指数达51.9%，处理组腐烂指数仅为31.1%。

图1 不同处理的芒果在贮藏过程中的病斑发展(A)和腐烂(B)情况Fig.1 Disease spot and decay status of mango fruits with different treatments during storage

2.2T. viride发酵液对接种发病率和自然发病率的影响

图2 T.viride发酵液和CMC处理对芒果采后发病率的影响Fig.2 Effect of individual and combined fermentation broth and CMC on the incidence rate of diseases in post-harvest mango fruits

在实验条件下，清水和CMC处理组芒果的发病率无明显差异。说明CMC对C. gloeosporioides不具有抑制作用。3个处理组的芒果自然发病率均随贮藏时间延长而增加，T. viride发酵液处理组的芒果自然发病率均低于其他处理组同期的发病率(图2)。贮藏至30d，T. viride发酵液处理组芒果发病率较清水处理组低36.7%。

接种处理后6d内，T. viride发酵液处理组接种发病率都维持在较低水平，对照组在第6天已出现发病高峰，说明T.viride发酵液有效延迟了芒果果实接种发病高峰。芒果果实接种处理至6d，T.viride发酵液处理显著降低了芒果果实接种发病率，仅为26.2%，对照组接种发病率已达76.4%。7d后，T.viride发酵液处理组与对照组间的差异逐渐缩小；第9天，两组芒果果实的接种发病率均超过98%(图3)。

图3 接种炭疽菌芒果的贮藏发病情况Fig.3 Effect of fermentation broth of Trichoderma viride on the disease incidence rate of mango fruits inoculated with Colletotrichum gloeosporioides during storage

2.3T.viride发酵液浓度对芒果果实发病情况的影响

图4 不同浓度T.viride发酵液处理芒果在贮藏期间的腐烂情况Fig.4 Effect of concentrated fermentation broth of Trichoderma viride on the decay index of mango fruits during storage

在相同贮藏时间内，随着T.viride发酵液浓度增加，芒果腐烂面积越小，且T. viride发酵液处理组芒果腐烂面积始终小于对照组(图4)。贮藏至6d，浓缩8、4、2倍的T. viride发酵液处理组芒果病斑面积分别为4.4、9.8、14.5cm2，均小于对照组(19.9cm2)。浓缩2、4、8倍的T. viride发酵液处理的芒果分别推迟1、2、2.5d，才达到对照组同等腐烂面积。

2.4T. viride发酵液对芒果果实硬度的影响

芒果采后随着贮藏期的延长，果实硬度减小。T.viride发酵液处理组和对照组的变化趋势相同，但硬度下降幅度不同(表1)。贮藏至第3天，对照组果实硬度急剧下降，由(10.76±0.45)kg/cm2骤降至(2.98± 0.31)kg/cm2(5d)；第6天，T.viride发酵液处理组的芒果硬度才出现急剧下降。第6天后，两处理组的果实均后熟软化，硬度差异不显著，维持在2.86～2.65kg/cm2范围内。

2.5T. viride发酵液对芒果色泽转化情况的影响

在贮藏过程中，T. viride发酵液混合CMC处理的芒果果实转黄较迟。贮藏至6d，该组果实的转黄率才有明显提高，达60.3%，其他两组的转黄率在第3天已达60%。仅用CMC处理的芒果果实速度较快，转黄率高于对照组果实，第9天时，色泽指数达85.2%，对照组仅为69.3%。贮藏至第9天，T. viride发酵液混合CMC处理组的色泽指数超过了对照组(图5)。

表1 贮藏过程中芒果硬度变化Table 1 Hardness change of mango fruits receiving and not receiving treatment with fermentation broth of Trichoderma viride during storage kg/cm2

图5 贮藏期间不同处理的芒果色泽变化Fig.5 Color change of mango fruits receiving and not receiving treatment with fermentation broth of Trichoderma viride during storage

3 讨论与结论

T.viride发酵液可显著减低损伤接种芒果的腐烂指数、病斑面积和接种发病率。贮藏至第9天，对照组的腐烂指数达51.9%，T.viride发酵液处理组腐烂指数为31.1%；损伤接种至7d时，T.viride发酵液处理组的病斑面积比对照组小69.7%；贮藏至30d，T.viride发酵液处理组自然发病率较对照组低36.7%。损伤接种7d后，T.viride发酵液处理组与对照组间的接种发病率差异逐渐缩小，第9天，两组芒果果实的接种发病率均超过98%，这是果实后熟及衰老的结果。结合前期的体外抑菌实验结果，这可能是T.viride发酵液中抗生物质对C.gloeosporioides的抑制作用，从而延缓了芒果的腐烂。关于T.viride发酵液中抗生物质组成，尚在进一步研究之中。

芒果是典型的呼吸跃变型果实，不耐贮藏。芒果采后随着贮藏期的延长，果实转黄，硬度下降。在室温(30±5)℃贮藏期间，T.viride发酵液处理组和对照组的硬度均不断下降，但T.viride发酵液处理组的芒果在贮藏5d后变软，比对照组推迟了2d。两处理组的芒果成熟软化后的硬度差异不显著，均维持在2.86～2.65kg/cm2范围内。果实后熟期间叶绿素降解，同时胡萝卜素等色素积累，果实由绿转黄。在贮藏过程中，3组芒果的颜色均逐渐由绿色转为黄色，色泽指数不断升高。不同处理组的转黄速度不同，T.viride发酵液混合CMC组＜对照组＜CMC组。

总而言之，T.viride发酵液处理能显著抑制芒果炭疽病的发生，减轻芒果采后病害，并延缓芒果的后熟生理作用，有利于芒果的贮藏、运输。这可能是因为T.viride发酵液处理后，抑制了芒果的呼吸作用，延迟了呼吸高峰的到来。黄雪莲[17]采用气相色谱-质谱联用仪对T.viride发酵液的化学成分进行定性分析，主要是(E,E)-2,4-己二烯醛、3-吡啶酚、甲基-(5-羟基-1H-2-苯并咪唑)氨基甲酸酯、柏木醇、δ-芹子烯、间氟苄胺、2,3-二氢-4H-1-苯并噻喃-4-酮、9-芴酮等。其抗生物质的抑制机理可能有两方面：1)抗生物质能够通过病原真菌的细胞膜，并改变真菌细胞的超微结构，破坏其细胞壁、细胞膜的结构与功能，引起细胞内容物流出导致真菌死亡；2)抗生物质通过抑制真菌的DNA、蛋白质的合成或RNA的转录而表现抑菌效应。关于T.viride发酵液诱导芒果采后抗病性的机制，还有待下一步研究，以期对T.viride发酵液处理对芒果采后病害的防治机理更深入了解。

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Effect of Fermentation Broth ofTrichoderma virideon Postharvest Diseases and Quality of Mango Fruits

YE Wei-juan1，FENG Wei-hua1，YU Xin1,*，WU Shao-hui1，JIANG Yu2
(1. College of Light Industry and Food Science, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China；2. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)

In order to control post-harvest diseases of mango, mango fruits (Mangifera indicaL. var Zihua) were coated with fermentation broth ofTrichoderma virideand stored under the conditions of 90%－95% humidity and (30 ± 5) ℃. Disease spot number, hardness and color index were determined during the storage of mango fruits. On the 9th day, the decay index of mango fruits from the control group was as high as 51.9%, while that of mango fruits coated with fermentation broth ofT. viridewas only 31.1%. On the 7th day after inoculation ofColletotrichum gloeosporioidesP. Henn, disease spot area in the coating group was 69.7%, which was much lower than that in the control group. On the 30th day during the storage, natural incidence rate of diseases in mango fruits coated with fermentation broth ofT. viridewas 36.7%, which was also lower than that in the blank control. The mango fruits treated with fermentation broth ofT. viridewere soften after 6-day storage and revealed an extension of shelflife by 3 days when compared with the control. Combined treatment with fermentation broth ofT. virideand CMC could result in a delay for turning yellow of mango fruits by 3 days. Therefore, fermentation broth ofT. viridecoating can significantly decrease decay index, disease spot area and the incidence rate of diseases in mango fruits.

Trichoderma viride；fermentation broth；Colletotrichum gloeosporioidesP. Henn；disease；quality

S667.7

A

1002-6630(2012)18-0265-05

2011-08-05

国家自然科学基金项目(30871765)

叶伟娟(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为农产品加工与贮藏工程。E-mail：yeweijuan0301@126.com

*通信作者：于新(1959—)，男，教授，博士，研究方向为农产品加工与贮藏。E-mail：yuxin1959@yahoo.com.cn