响应面分析优化菊粉的羧甲基改性工艺

李丹丹，王雪娇，周 杰，潘 烨，王 爽，高学佳

(1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018；2.贵州大学生命科学学院，贵州 贵阳 550025)

响应面分析优化菊粉的羧甲基改性工艺

李丹丹1，王雪娇1，周 杰2，潘 烨1，王 爽1，高学佳1

(1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018；2.贵州大学生命科学学院，贵州 贵阳 550025)

研究菊粉的羧甲基改性工艺条件，以碱化时间、醚化温度、醚化时间、碱用量以及氯乙酸用量为影响因素，以羧甲基的取代度为考察指标，运用Plackett-Burman设计筛选出3个对菊粉羧甲基取代度影响显著因素，即碱化时间、醚化温度和氯乙酸用量，采用响应面分析试验优化菊粉的羧甲基改性工艺。菊粉的羧甲基改性最优工艺条件为菊粉用量6.8g、碱化时间30min、醚化温度81℃、氯乙酸用量2.96g，此时菊粉的羧甲基取代度为0.66± 0.000167。

菊粉；羧甲基改性；Plackett-Burman试验；响应面分析

菊粉又称为菊糖，在菊科植物如菊芋、大丽菊等的块茎和菊苣、牛蒡等的根中含量丰富，在植物中代替淀粉成为贮存多糖，是一种功能性的天然寡糖[1-2]。菊粉主要是由β-(2→1)果糖基-果糖为糖苷键连接而成的一种果聚糖，其果糖基单位(即聚合度，degree of polymerization，DP)从2个到60个不等[3]。菊粉具有降血脂[4]、促进金属离子的吸收[5-6]、增殖双歧杆菌、调节肠道环境[7-9]等功能。同时菊粉已经被FDA批准进入美国市场，并且在日本、欧洲、美国、台湾等地被认为是食品和营养的增补剂而非食品添加剂，广泛应用于食品工业中[10]。几乎所有的资料都表明，菊粉和低果聚糖不存在安全性方面的担忧，研究证明摄人量为40～70g/d时无不良的影响[11]。

目前，国内对菊粉的研究还局限在应用研究上，对菊粉的改性研究较少。国外对菊粉改性的研究越来越重视。目前国外研究较多的改性方式为甲氨酰化、酯化、烷氧基化等。改性菊粉多用于工业表面活性剂制备，改善水分表面张力或做为食品工业水处理的阻垢剂等。胡娟等[12]用菊粉与十八烷基异氰酸酯在有机溶剂中发生甲氨酰化反应，研究发现生成的氨甲基菊粉具有表面活性。羧甲基菊粉由菊粉分子上的伯醇或仲醇基团与氯乙酸等含有羧基基团(—COOH)的化合物在碱性条件下进行取代反应而形成。Verraest等[13]对菊粉的羧甲基改性进行了研究，并用液相色谱和核磁共振对改性的菊粉进行了分析。Johannsen[14]对羧甲基菊粉的毒理学性质进行了研究，结果表明具有良好阻垢效果的羧甲基菊粉的安全性和菊粉是一样的，可以在日常膳食中放心食用。目前世界范围内，国外科研机构对菊粉改性的研究相对成熟，但也只有荷兰的Sensus和比利时的Solutia两家公司在对菊粉衍生物进行联合开发，投入大规模商业生产的菊粉衍生物目前仅有羧甲基菊粉，所使用的菊粉是从莴苣的种子中提取的。由于羧甲基菊粉是绿色环保产品，而且功能独特，因而畅销于欧美市场。

本研究以菊粉为原料制备羧甲基菊粉，其中碱化时间、醚化温度、醚化时间、碱用量以及氯乙酸用量均对羧甲基的取代度有不同程度的影响，通过Plackett-Burman试验和响应面分析确定菊粉羧甲基改性的最佳工艺条件，以期为今后菊粉的改性研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菊粉 荷兰Sensus公司。

氢氧化钠、氯乙酸、无水乙醇(均为AR) 河北省石家庄市金陵科教试验设备公司。

1.2 仪器与设备

PL203型电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；HH-2型数显恒温水浴锅 金坛市杰瑞而电器有限公司；756P型紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；电子搅拌器 上海电子仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菊粉羧甲基改性工艺流程

菊粉在室温(25℃)溶解度为13.6%，因此取6.8g菊粉溶解于50mL水中进行实验。

1.3.2 菊粉羧甲基取代度的测定[15]

采用光度滴定法对菊粉的羧甲基化进行测定，因羧甲基菊粉与二价铜离子的螯合物在241nm波长处有较强的光吸收。用铜离子浓度为0.8×10-3mol/L的硫酸铜溶液滴定0.5g/L的羧甲基菊粉钠溶液。令羧甲基菊粉钠与二价铜离子生成螯合物，使用紫外-可见分光光度计在241nm波长处进行滴定。随滴定进行样品溶液的吸光度不断增大，滴至螯合完毕，吸光度趋于恒定。此时通过消耗的硫酸铜溶液的体积可求得羧甲基的含量，进而计算出菊粉羧甲基化的取代度。取代度计算公式：

式中：W为取代基质量分数/%；M为取代基相对分子质量。

1.3.3 Plackett-Burman试验

采用Plackett-Burman设计法和Minitab15数据处理软件创建试验次数N＝12的试验，对碱化时间(A)、醚化时间(B)、醚化温度(D)、氢氧化钠用量(E)、氯乙酸用量(G)5个因素进行考察，另设3个虚拟列(C、F、H)，以考察试验误差，以羧甲基取代度为响应值考察各因素对菊粉羧甲基取代度影响的显著性。

1.3.4 响应面分析

响应曲面分析法(response surface methodology，RSM)是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法。本试验利用Design-Expert 6.0.10数据处理软件设计一个3因素3水平共15个试验点的试验，得到最佳的菊粉羧甲基改性工艺条件。

2 结果与分析

2.1 Plaekett-Burman试验筛选结果

选用试验次数N＝12的试验设计，对8个因素(5个实际因素、3个虚拟因素)进行考察，分别对应于表1的8列，每个因素取2个水平，以羧甲基取代度为响应值。选择置信度较高的因素作为显著因素进一步考察，试验设计及结果如表1所示，各因素主效应分析结果如表2所示。

表1 Plackett-Burman试验设计表及试验数据Table 1 Plackett-Burman design and experimental results

表2 Plaekett-Burman试验设计的因素、水平及显著性分析Table 2 Factors and levels used in Plackett-Burman design and significance analysis

取代度和羧甲基改性的多糖性能有直接关系。低取代度产品在某些性能上存在一定的局限性，主要表现在：水溶液抗生物降解性及抗温性差，在冷水中溶解性较差，抗酸性及抗钙镁离子能力低等，这些缺陷会随着取代度的增加而减弱。而取代度高的产品具有黏度高且稳定，抗酸、抗盐、耐剪切等性能而更能满足许多产品性质的需求[16-17]。由表1、2可以看出，因素碱化时间、醚化温度、氯乙酸用量3个因素对羧甲基取代度的影响效果显著，所以将碱化时间、醚化温度和氯乙酸用量这3个因素进行进一步优化。

2.2 响应面分析法优化菊粉羧甲基化改性的条件

2.2.1 响应曲面试验设计及结果

以Plackett-Burman试验筛选出得3个显著因素，结合单因素试验，进行响应面分析试验。响应面因素及水平见表3，响应面设计及试验结果见表4。2.2.2 拟合模型的建立及显著性分析

表3 菊粉羧甲基化改性响应面试验设计的因素与水平Table 3 Factors and levels used in response surface analysis

表4 菊粉羧甲基化改性响应面试验设计及结果Table 4 Experimental design and results for response surface analysis

利用Design-Expert 6.0.10软件对表4中的试验数据进行多元回归拟合，得到菊粉羧甲基取代度对碱化时间、醚化温度和氯乙酸用量的二次多项回归模型方程为：

取代度＝－0.88130＋0.053563A＋0.011877B＋0.19479C－8.51337×10-4A2－8.50370×10-5B2－0.038148C2＋2.85955×10-6AB－7.02621×10-4AC＋6.41421×10-4BC(2)

表5 回归模型方差分析Table 5 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

由表5可知，回归模型的的F值为56.03，P＝0.0002＜0.01，表示该模型极显著。失拟项的F值为2.56，P＝0.1848＞0.05，说明失拟项不显著。由表5可知，B、A2、B2、C2项的影响是显著的，而A、C、AB、BC、AC项对菊粉羧甲基化取代度的影响是不显著的。3个试验条件对取代度影响的主次顺序为B＞C＞A。

2.2.3 响应曲面交互作用分析及优化结果

根据回归分析结果做出A、B、C及各因素之间的交互作用对羧甲基取代度的影响如图1所示。

图1 各因素及交互作用对菊粉羧甲基取代度的影响Fig.1 Response surface of factors and interactions on the degree of substitution of carboxymethyl inulin

从图1可以看出，每个因素都有双向增长，即因素值增大则响应值增大；当因素取值增大到一定值时，响应值达到极值，之后随着因素的增大，响应值逐渐减小。这是因为碱化时间过短，则构建活性中心不完全影响最终试验结果；碱化时间过长，则构建的活性中心被破坏，也会使最终的取代度变小。醚化温度低时，分子活性不足影响取代基取代过程；醚化温度高时，添加的取代基会断裂，分子分解，也会使最终的取代度变小。氯乙酸用量少时，取代基添加量少，氯乙酸利用率低；氯乙酸用量过多时，会破坏构建的活性中心，也会使最终的取代度变小。

通过对响应曲面的交互作用分析后，发现各因素之间的交互作用对取代度有重要的影响。因此需要对提取条件进行优化。根据回归模型，通过软件分析得到菊粉羧甲基改性的最优工艺条件为碱化时间30.37min、醚化温度81.47℃和氯乙酸用量2.96g，在此条件下，菊粉的羧甲基取代度的理论值为0.70，为检验响应曲面法所得结果的准确性和可靠性，又考虑实际操作的便利，将最优提取工艺条件修正为碱化时间30min、醚化温度81℃和氯乙酸用量2.96g，在修正后的优化提取工艺条件下，羧甲基菊粉的取代度为0.66±0.000167，因此采用响应曲面法所得的优化提取工艺参数准确、可靠。

3 结 论

本实验通过Plackett-Burman试验和响应面分析，确定菊粉羧甲基改性的最优工艺条件为碱化时间30min、醚化温度81℃和氯乙酸用量2.96g。在此条件下羧甲基菊粉的取代度为0.66±0.000167。3个试验因素对取代度影响的主次顺序为B＞C＞A。本研究还有一些需要进一步研究解决的问题，如对羧甲基菊粉的毒理学研究、羧甲基菊粉做为阻垢剂的应用效果等有待于今后进一步深入研究。

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Optimization of Inulin Carboxymethylation by Response Surface Analysis

LI Dan dan1，WANG Xue-jiao1，ZHOU Jie2，PAN Ye1，WANG Shuang1，GAO Xue-jia1
(1. College of Biological Science of Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China；2. College of Life Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

In order to find optimal conditions for the the carboxymethylation of inulin, we investigated the effects of amount of NaOH used for alkalization reaction, alkalization time, amount of chloroacetic acid used for etherification, and etherification temperature and time on substitution degree of carboxymethyl inulin. Using Plackett-Burman design, we identified alkalization time, etherification temperature and chloroacetic acid amount as important conditions that influence substitution degree of carboxymethyl inulin. Response surface methodology was employed to optimize the important conditions. Optimal carboxymethylation of inulin was achieved by alkalization for 30 min and etherification with 2.96 g of chloroacetic acid per 6.8 g of inulin at 81 ℃. The substitution degree of the obtained carboxymethyl inulin was 0.66 ± 0.000167.

inulin；carboxymethylation；Plackett-Burman design；response surface methodology

TS213.2

A

1002-6630(2012)18-0063-04

2011-07-05

李丹丹(1981—)，女，讲师，博士，研究方向为碳水化合物与生物技术。E-mail：dandan_jiejie@yahoo.com.cn