高温米糠粕碱不溶蛋白的酶法提取

马永强，殷嘉音，周雪松，张 娜，王 雪，杨 楠

(1.哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076；2.黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076；3.黑龙江省北大荒米业集团有限公司，黑龙江 哈尔滨 150036)

高温米糠粕碱不溶蛋白的酶法提取

马永强1,2，殷嘉音1,2，周雪松3，张 娜1,2，王 雪1,2，杨 楠1,2

(1.哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076；2.黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076；3.黑龙江省北大荒米业集团有限公司，黑龙江 哈尔滨 150036)

以高温米糠粕为基础原料，通过酶解能力比较，确定碱性蛋白酶对高温米糠粕中碱不溶性蛋白的作用效果最佳。通过单因素试验分析酶添加量、作用温度、pH值和酶解时间对蛋白提取效果的影响。通过正交试验确定最佳提取工艺：碱性蛋白酶添加量300U/g、提取温度55℃、pH8.5，蛋白提取率可达28.9%。

高温米糠粕；碱性蛋白酶；蛋白提取率；碱提法

米糠是水稻制米过程中产生的副产物，其中富含蛋白质、脂肪、维生素、纤维素等，米糠中营养物质的含量几乎占大米营养价值的60%。我国水稻播种面积大、产量高，总产量在1.8～2亿吨左右，占全国粮食总产量的42%，占世界稻谷总产量的35%左右[1-2]。目前我国米糠资源拥有量在1000万吨左右，资源十分丰富，是一种量大面广的可再生资源[3]。

米糠中的蛋白是一种优质蛋白，与酪蛋白、大豆分离蛋白中氨基酸组成相比，米糠蛋白中氨基酸能很好满足2～5岁儿童对氨基酸的需要[4]，其氨基酸组成更接近FAO/WHO推荐模式[5]。姚惠源等[6]对米糠蛋白进行了系统的研究，指出米糠中清蛋白占34%～40%，球蛋白占33%～39%，醇溶蛋白占3%～8%和谷蛋白占19～25%。但是具体化到我国米糠加工利用的实际情况，却与上述研究结论存在较大的偏差。为了防止米糠中的油脂氧化酸败，米糠都经过了热稳定化处理，尤其是在我国现行制米工艺和米糠油生产工艺中，米糠(粕)中的蛋白相当部分发生了变性后的凝聚过程，实际的可溶蛋白比例大大低于上述结论。米糠蛋白的提取方法主要包括：碱法提取[7]、蛋白酶法[8]、非蛋白酶法[9]、多聚糖沉淀法[10]和亚临界水提取法[11]等。其中，碱法提取是公认的提取工艺简便、提取率较高的方法[12]。但是对于经热稳定化浸提米糠油的糠粕，碱法的提取效率也大打折扣，所以考虑对米糠进行不同提取技术的复合处理就非常必要了。

本研究针对高温米糠粕中的高变性蛋白，将不同的蛋白酶作用于其中的碱不溶性蛋白，确定蛋白酶对高变性并发生部分凝聚的蛋白的水解能力，为蛋白酶法提取米糠蛋白的工艺研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高温米糠粕 黑龙江北大荒米业有限公司；碱性蛋白酶 天津利华酶制剂有限公司；中性蛋白酶(400U/g)无锡酶制剂有限责任公司；复合蛋白酶(500U/g)、风味蛋白酶(550U/g) 诺和诺德(天津)生物技术有限公司；磷酸氢二钠(分析纯)、磷酸二氢钠(分析纯) 哈尔滨市新春化工厂；盐酸(化学纯) 哈尔滨市新达化工厂；氢氧化钠(化学纯) 天津市大陆化学试剂厂；甲基红(分析纯)、亚甲基蓝(分析纯) 天津市化学试剂六厂。

1.2 仪器与设备

TGL-16G-B台式高速离心机 湖南星科科学仪器有限公司；HYP-1008消化炉 上海纤检仪器有限公司；W201B恒温水浴锅 上海跃进医疗器械厂；中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；H198/28型pH计测试笔 北京海星顺达公司；BS224S型电子分析天平 赛多利斯科学仪器有限公司；HNY-100B恒温培养振荡器 天津市欧诺仪器仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高温米糠粕的基础成分分析

水分含量的测定：GB5009.3—2010《食品中水分的测定》；总蛋白及可溶蛋白含量测定：GB/T5009.5—2003《食品中蛋白质的测定》凯氏定氮法；脂肪含量的测定：GB/T5009.6—2003《食品中脂肪的测定》索氏抽提法；总糖含量的测定：GB/T 15672—2009《食用菌中总糖含量的测定》；纤维含量的测定：GB/T 9822—1988《谷物不溶性膳食纤维测定法》；植酸含量的测定：GB/T 5009.153—2003《植物性食品中植酸的测定》；灰分含量的测定：GB 5009.4—2010《食品中灰分的测定》。

1.3.2 高温米糠粕蛋白的碱法提取工艺流程

高温米糠粕→称取原料→加入一定量的氢氧化钠溶液→在不同温度下提取一定时间→离心分离(4500r/min，15min) →收集上清液→用凯氏定氮法对清液和下沉物进行蛋白含量测定

1.3.3 碱不溶蛋白的蛋白酶法提取

1.3.3.1 蛋白酶的选择

选取碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶和风味蛋白酶4种蛋白酶，分别在该酶最优反应条件下提取高温粕中的蛋白质，以蛋白质提取率为指标确定作用效果最佳的酶。

1.3.3.2 碱性蛋白酶酶解单因素试验

1) 碱性蛋白酶添加量对酶解效果的影响

分别准确称取5份1.3.2节中的下沉物各10g，调节pH8，提取温度55℃，然后分别在碱性蛋白酶添加量为100、200、300、400、500U/g的条件下提取3h，然后4500r/min离心15min，收集上清液，测定上清液中蛋白质含量。

2) 温度对碱性蛋白酶酶解效果的影响

分别准确称取5份1.3.2节中的下沉物各10g，调节pH8，添加碱性蛋白酶300U/g，然后分别在温度45、50、55、60、65℃的条件下提取3h，然后4500r/min离心15min，收集上清液，测定上清液中蛋白质含量。3) pH值对碱性蛋白酶酶解效果的影响

分别准确称取5份1.3.2节中的下沉物各10g，添加碱性蛋白酶300U/g，提取温度55℃，然后在pH值分别为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0条件下提取3h，然后在4500r/min离心15min，收集上清液，测定上清液中蛋白质含量。

4) 反应时间对碱性蛋白酶酶解效果的影响

分别准确称取5份1.3.2节中的下沉物各10g，调节pH8，添加碱性蛋白酶300U/g，提取温度55℃，然后分别提取2.0、2.5、3.0、3.5、4.0h，然后在4500r/min离心15min，收集上清液，测定上清液中蛋白质含量。

1.3.3.3 碱性蛋白酶酶解正交试验

在单因素试验的基础上进行L9(34)正交试验，确定碱性蛋白酶对高变性米糠蛋白作用工艺条件，因素水平见表1。

表1 L9(34)正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design L9(34)

1.3.4 蛋白质提取率计算

2 结果与分析

2.1 高温粕米糠基础成分测定

表2 高温粕米糠基础成分Table 2 Proximate chemical composition of high temperature meal rice bran

2.2 高温米糠粕蛋白的碱法提取

经实验研究，碱法提取的蛋白提取率可达33.2%，下沉物中蛋白含量2.58g/100g湿基，下沉物水分含量74.2%。

2.3 蛋白酶的筛选

用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶在特定的条件下对米糠蛋白进行水解，测得蛋白质提取率见图1。

图1 不同蛋白酶对蛋白质提取率的影响Fig.1 Effect of different proteases on extraction rate of alkali insoluble protein

由图1可知，碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶4种酶在其最优作用条件的情况下提取高温粕中的蛋白，碱性蛋白酶最用效果最好。由于碱性蛋白酶是内切酶，可以把大的蛋白质分子降解为小分子从而有利于蛋白质的溶出，碱性溶液环境可以更好的溶解碱溶性的谷蛋白，所以本实验采用碱性蛋白酶来提取高温粕中的蛋白质。另外，王文高等[13]曾分别用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合风味蛋白酶来提取蛋白质，经试验得出碱性蛋白酶的作用效果最好，提取率最高。

2.4 碱性蛋白酶酶解单因素试验

2.4.1 碱性蛋白酶添加量蛋白质提取率的影响

图2 蛋白酶添加量对蛋白质提取率的影响Fig.2 Effect of alkaline protease dose on extraction rate of alkali insoluble protein

由图2可得，蛋白质的提取率随着蛋白酶添加量的增加而增多。但当蛋白酶添加量到达300～500U/g的时候，蛋白质提取率趋于平缓，所以300U/g为最优添加量。

2.4.2 温度对蛋白质提取率的影响

图3 温度对蛋白质提取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of alkali insoluble protein

由图3可知，当温度在45～50℃的时候蛋白质提取率在随着温度的升高而增加，当温度达到55℃时，蛋白质提取率达到最大为26.7%。温度超过55℃时蛋白质提取率有所下降。酶的作用都有一个最适作用温度，超过这个温度，蛋白酶的活性降低。由此可知，蛋白酶作用最优温度为55℃。

2.4.3 pH值对蛋白质提取率的影响

图4 pH值对蛋白质提取率的影响Fig.4 Effect of pH on extraction rate of alkali insoluble protein

由图4可知，蛋白质提取率随着pH值的增加而升高，但当pH值超过8时，蛋白质提取率增加平稳，选pH8作为最优条件。由于碱性蛋白酶在碱性环境下有最适反应，所以溶液p H值越高，提取效果越好。

2.4.4 时间对蛋白质提取率的影响

图5 时间对蛋白质提取率的影响Fig.5 Effect of extraction time on extraction rate of alkali insoluble protein

由图5可知，蛋白质提取率随着温度的增加而升高，但当温度超过3 h时，蛋白质提取率增加平稳，在一定时间范围内，蛋白酶能够和蛋白质完全作用，反应已完成。继续作用底物浓度将变小，产物浓度增加，会产生抑制作用，所以选酶解时间等于3h作为最优条件。

2.5 碱性蛋白酶正交试验

表3 碱性蛋白酶提取蛋白质正交试验设计及结果Table 3 Orthogonal array design protocol and corresponding results

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

由表3、4可知，各因素对蛋白质提取率影响的主次顺序为A＞C＞B，即碱性蛋白酶添加量＞pH值＞温度。其中碱性蛋白酶添加量、pH值比对实验结果影响具有显著性差异(P＜0.05)，提取温度在一定范围内对实验结果影响不具有统计学意义(P＞0.05)。

实验确定最佳提取条件为A2B2C3，即碱性蛋白酶添加量为300U/g、提取温度为55℃、pH8.5。最高提取率为28.9%。王立等[14]研究了不同蛋白酶提取大米蛋白，实验得出碱性蛋白酶作用效果最好，蛋白质的提取率高达80.03%。刘颖等[15]研究了不同蛋白酶提取米糠蛋白，得出结论碱性蛋白酶作用后的米糠蛋白的氮溶解指数有明显的提高，可达到95.42%。本实验的提取率有一定差距，原因主要是原料的不同，高温粕的成分更加复杂，分子间结构互相连接更加紧密，使酶作用效果降低。

3 结 论

研究表明，高温米糠粕中的可溶性蛋白比例较低，其NSI值仅为11.6%，属高变性蛋白[16]。但其他研究者的报告中鲜有关于低变性米糠蛋白NSI值方面的内容，所以无法进行比较。对于这样高变性并发生部分凝聚的米糠蛋白，在所选的碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶和风味蛋白酶中，碱性蛋白酶对其的水解效果较为突出，这可能与弱碱性条件下，蛋白表面疏水性氨基酸残基部分外翻，导致蛋白结构疏松有关。

通过单因素试验和正交试验优化，确定碱性蛋白酶对高变性米糠蛋白作用过程的影响程度依次序为碱性蛋白酶添加量＞pH值＞反应温度。最佳酶解条件组合为碱性蛋白酶添加量300U/g、提取温度55℃、pH8.5。在此条件下，蛋白的提取率可达28.9%。与其他研究者的报告相比较，本研究的提取率较低，但是因为其他研究者一般选用的实验材料为低变性米糠，所以两者之间的比较没有参考意义。

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Enzymatic Extraction of Alkali Insoluble Protein from High Temperature Rice Bran Meal

MA Yong-qiang1,2，YIN Jia-yin1,2，ZHOU Xue-song3，ZHANG Na1,2，WANG Xue1,2，YANG Nan1,2
(1. College of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China；2. Key Laboratory of Food Science and Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China；3. Heilongjiang Beidahuang Rice Industry Group Co. Ltd., Harbin 150036, China)

The effectiveness of four different proteases in hydrolyzing high temperature rice bran meal for enzymatic extraction of alkali insoluble protein was compared to identify alkaline protease as the best choice. The effects of alkaline protease dose, temperature, pH and hydrolysis time on extraction efficiency were explored by one-factor-at-a-time design. Using orthogonal array design, the optimal conditions of alkaline protease dose, temperature, and pH were determined to be 300 U/g, 55 ℃, and 8.5, respectively. Under these conditions, the extraction yield of alkali insoluble protein was up to 28.9%.

high temperature rice bran meal；alkaline protease；protein extraction rate；alkali extraction

TS209

A

1002-6630(2012)18-0032-04

2012-04-10

黑龙江省高校科技创新团队建设计划项目(2010td04)；哈尔滨市科技攻关计划项目(2009AA6BN074)；黑龙江省科技厅科技攻关项目(GC12B403)

马永强(1963—)，男，教授，硕士，研究方向为农产品化学与综合利用。E-mail：mayq@hrbcu.edu.cn