碱溶性东北山核桃蛋白的提取及SDS-PAGE分析

于阳阳，包怡红*

(东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

碱溶性东北山核桃蛋白的提取及SDS-PAGE分析

于阳阳，包怡红*

(东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

以经超临界CO2去除油脂后的东北山核桃仁渣为原料，利用碱提法对山核桃渣进行蛋白质提取，考察NaOH溶液浓度、料液比、提取温度、提取时间4个因素对蛋白提取率的影响，并在单因素试验的基础上设计正交试验，确定碱溶性山核桃仁蛋白最佳提取条件和其等电点。同时对碱溶性山核桃蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。结果表明：当提取液NaOH浓度0.02mol/L、料液比1:30(g/mL)、提取温度50℃、提取时间1.5h时，碱溶性山核桃蛋白提取率最大可达88.05%，其等电点为4.5。SDS-PAGE分析结果表明，碱溶性山核桃蛋白分子质量主要分布在100、60、36kD和20kD 四个区域。

山核桃；碱溶性蛋白；提取；SDS-PAGE；分子质量

东北山核桃即核桃楸(Juglans mandshurica)属于胡桃科胡桃属，又名胡桃楸、楸子或山核桃。主要分布于我国黑龙江大、小兴安岭，吉林，辽宁，内蒙古东部，河北，山西，河南等地[1]。

东北山核桃果仁中含有丰富的蛋白质、8种人体必需氨基酸酸、矿质元素、多种不饱和脂肪酸和维生素，而碳水化合物的含量较低[2]。东北山核桃属纯天然野生坚果类，与核桃相似，具有润肺、强肾、降低血脂、预防冠心病的功能，长期食用能够益寿养颜、抗衰老，孕妇食用对胎儿智力发育有很好的帮助[3-6]。

目前以东北山核桃为原料的研究，主要集中在其种仁中油脂的提取和功能方面。苏玖玲等[7]研究了以山核桃为原料，利用有机溶剂法、超临界CO2提取法和酶法提取油脂，得到最佳工艺条件，并对核桃油的稳定性和降血脂功能进行了初步分析。而以脱脂后的山核桃渣为原料，研究其蛋白质提取的报道还较少见。SDS电泳是测定蛋白质亚基分子质量的一种简单、快速、可靠的方法，如大豆蛋白、白果蛋白、苦荞麦蛋白等蛋白质的分子质量已经通过该方法测定[8-10]。

本实验以粉碎后经超临界CO2去除油脂的东北山核桃仁(即核桃渣)为原料，提取其碱溶性蛋白质，通过正交试验确定最佳提取条件，同时确定碱溶性山核桃蛋白的等电点。并利用SDS电泳检测出碱溶性山核桃仁蛋白质的分子质量分布。旨在为今后东北山核桃蛋白质的进一步科学研究和综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

经过超临界CO2脱脂的东北山核桃仁渣山核桃渣。SDS-PAGE电泳所用试剂、蛋白质电泳Marker等。

1.2 仪器与设备

DYY-6C型电泳仪 北京六一仪器厂；电泳自动成像仪美国BIO-RAD生化科技有限公司；DK-98-1电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司；T6新世纪紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；PB-10标准型酸度计 上海沪粤明科学仪器有限公司；凯氏定氮装置。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理

将筛选好的山核桃仁粉碎后，经超临界CO2萃取核桃油，操作条件为压力35MPa、分离温度40℃、时间4h[7]。脱脂后的山核桃渣过40目筛后备用，其中蛋白质含量测定采用微量凯氏定氮法[11]。

1.3.2 碱溶性山核桃蛋白提取率测定

准确称取1.000g的脱脂山核桃渣→NaOH溶液提取→4000r/min，离心10min→上清液稀释一定倍数后，采用福林-酚比色法[12]测定上清液蛋白含量。

1.3.3 碱溶性山核桃蛋白等电点测定

原料经碱溶液提取后，4000r/min，离心10min取上清蛋白液，加入0.1mol/L HCl溶液调pH值分别为2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8，混合均匀，静置30min，4000r/min，离心10min，去上清液后，称量下层沉淀质量，沉淀量最多的即为碱溶性山核桃蛋白的等电点[13]。

1.3.4 碱溶性山核桃蛋白提取的单因素试验

以NaOH溶液为提取液，在固定提取工艺条件：提取温度45℃、提取时间2h、料液比1:30(g/mL)、NaOH溶液浓度0.01mol/L情况下，分别考察NaOH溶液浓度0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1mol/L，料液比1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60，提取温度35、40、45、50、55、60℃，提取时间1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h对山核桃蛋白提取率的影响。

1.3.5 正交试验

根据单因素试验结果，以NaOH溶液浓度、料液比、温度、时间为考察因素进行L9(34)正交试验，试验因素及水平见表1。

表1 碱溶性山核桃蛋白的提取工艺优化正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels tested in orthogonal array design

1.3.6 SDS-PAGE凝胶电泳试验

采用电泳仪进行不连续双垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳[14]。将山核桃蛋白提取液与样品缓冲液(pH6.8、1mol/L Tris-HCl缓冲液1.6mL、甘油2.0mL、10% SDS 4.0mL、质量分数0.1%溴酚蓝0.5mL、β-巯基乙醇1.0mL、去离子水定容至20mL)按1:1的体积比例混合，100℃煮沸5min，10000r/min，离心10min，上样20μL，分离胶质量浓度12mg/100mL，浓缩胶质量浓度5mg/100mL。开始电压80V，进入分离胶后110V，电泳时间2.5～3.5h。考马斯亮蓝R-250热染20min，放入脱色液中摇床脱色，直至胶片背景蓝色完全透明状，电泳自动成像仪拍照。

2 结果与分析

2.1 样品蛋白质含量

东北山核桃仁粉碎后经超临界CO2在压力35MPa、分离温度4 0℃、时间4 h的条件下脱脂后得试验样品，样品山核桃渣经凯氏定氮测得其粗蛋白质含量为55.032%。

2.2 碱溶性山核桃蛋白等电点测定

图1 碱溶性山核桃蛋白质等电点Fig.1 Isoelectric point of alkali-soluble pecan proteins extracted from Juglans mandshurica Maxim kernel

由图1可知，当pH值由2逐渐升高时，沉淀蛋白含量逐渐增加，pH4.5时，蛋白沉淀量最多为12.29mg。p H值继续升高超过5.5时，蛋白沉淀量减少。当蛋白质处于等电点附近时，其溶解性较低，易沉淀，根据图示结果，确定碱溶性山核桃蛋白的等电点为4.5。

2.2 碱溶性山核桃蛋白提取单因素试验

2.2.1 提取液浓度对山核桃蛋白提取率的影响

图2 NaOH溶液浓度对山核桃蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of NaOH concentration on the extraction yield of alkalisoluble proteins

由图2可知，随着碱液浓度逐渐增加蛋白质提取率也随之增加，碱液浓度增加至0.01mol/L时，蛋白质提取率增加较明显，当碱液浓度0.05mol/L时提取率达到最大为85.379%，碱液浓度继续增加，蛋白质提取率有下降趋势。碱液浓度增加在一定范围内可提高碱溶性蛋白的提取率，但浓度过高，可能会导致蛋白质结构改变而变性，使其提取率下降。同时，碱液浓度过大，使蛋白提取液碱性过强，限制了其利用范围。综合考虑，确定提取所用NaOH溶液的浓度为0.01mol/L。

2.2.2 料液比对山核桃蛋白提取率的影响

图3 料液比对山核桃蛋白质提取率的影响Fig.3 Effect of material-to-solvent ratio on the extraction yield of alkali-soluble proteins

由图3可知，随着提取剂用量的增加，蛋白质提取率增加，当料液比为1:30时，蛋白质提取率达80.087%，提取剂用量继续增加，蛋白质提取率增加不明显。考虑到实际操作方便和成本问题，确定1:30为最佳料液比。

2.2.3 提取温度对山核桃蛋白提取率的影响

由图4可知，当提取温度从35℃升高到45℃时，蛋白质提取率也随之增加，温度45℃时，蛋白质提取率最高为82.325%。但温度继续升高时，蛋白质提取率随之下降，其原因是，高温可导致蛋白质变性，溶解性降低。

图4 提取温度对山核桃蛋白提取率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction yield of alkali-soluble proteins

2.2.4 提取时间对山核桃蛋白提取率的影响

图5 提取时间对山核桃蛋白提取率的影响Fig.5 Effect of extraction time on the extraction yield of alkali-soluble proteins

由图5可知，随提取时间延长，原料蛋白质提取率增加，1.5h达到最大为83.034%，提取时间继续延长，可能由于作用时间过长而导致蛋白质变性，使其提取率下降。所以，确定最佳提取时间为1.5h。

2.3 山核桃蛋白质提取工艺优化正交试验

表2 山核桃蛋白质提取工艺优化正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal array design and corresponding results

由表2可知，影响山核桃蛋白提取率的因素主次顺序为A(NaOH溶液浓度)＞B(料液比)＞D(提取时间)＞C(提取温度)。最佳提取山核桃蛋白的工艺为A3B2C3D2，即在NaOH溶液浓度0.02mol/L、料液比1:30、提取温度50℃、提取时间1.5h条件下，山核桃蛋白的提取率最大。在最佳提取工艺条件进行验证实验，山核桃蛋白质平均实际提取率为88.05%。

2.4 SDS-PAGE凝胶电泳试验结果

图6 碱溶性山核桃蛋白的SDS-PAGE图Fig.6 SDS-PAGE of alkali-soluble pecan proteins extracted from Juglans mandshurica Maxim kernel

由图6可知，电泳结果条带清晰，可以看出来碱溶性山核桃蛋白分子质量较低，主要为100、60、36、20kD。Labuckas等[15]对核桃蛋白的研究结果发现：利用0.1mol/L Na2B4O7提取的蛋白质分子质量条带清晰可见，而利用0.1mol/L NaOH溶液提取的蛋白质分子质量基本在100kD以下，但是电泳条带弥散不清，不能确定具体分子质量大小。可见不同提取液及提取液浓度均可导致得到的蛋白质分子质量的不同。

3 结 论

本实验以经超临界CO2去除油脂后的东北山核桃渣为原料，利用碱提法对山核桃渣进行蛋白质的提取，根据单因素和正交试验结果可知，影响山核桃蛋白提取率的因素主次顺序为A(NaOH溶液浓度)＞B(料液比)＞D(提取时间)＞C(提取温度)。碱溶性山核桃仁蛋白最佳提取条件为NaOH溶液浓度0.02mol/L、料液比1:30、提取温度50℃、提取时间1.5h，此条件下碱溶性山核桃蛋白提取率最大为88.05%。通过试验确定碱溶性山核桃蛋白质等电点为4.5。对碱溶性山核桃蛋白进行SDS-PAGE分析，结果表明，其分子质量主要分布在100、60、36kD和20kD 四个区域。

[1]任宪威. 树木学(北方本)[M]. 北京: 中国林业出版社, 2005: 170.

[2]韩喜江, 张颖. 黑龙江省山核桃仁的营养成分分析[J]. 东北农业大学学报, 1996, 27(1): 87-90.

[3]SALCEDO C L, de MISHIMA B A L,NAZARENO M A. Walnuts and almonds as model systems of foods constituted by oxidisable, prooxidant and antioxidant factors[J]. Food Research International, 2010,43(4): 1187-1197.

[4]李艳伏, 徐怀德, 陈金海, 等. 木瓜蛋白酶酶解核桃粕蛋白产物抗氧化活性研究[J]. 中国食品学报, 2008(5): 8-14.

[5]包怡红, 盛和静. 山核桃蛋白多肽的制备及对羟自由基的清除作用[J]. 食品科学, 2005, 26(9): 515-518.

[6]崔莉, 葛文光. 核桃蛋白质功能性质的研究[J]. 食品科学, 2000, 21(1): 14-16.

[7]苏玖玲. 核桃楸油的提取、稳定性及降血脂功能研究[D]. 东北林业大学, 2008.

[8]黄惠华, 高孔荣, 郭乾初, 等. 大豆原料及其分离蛋白的SDS-PAGE图谱研究[J]. 食品科学, 2000, 21(6): 15-19.

[9]李莹莹, 吴彩娥, 杨剑婷, 等. 白果蛋白质提取及SDS-PAGE分析[J].食品科学, 2010, 31(22): 36-40.

[10]张超. 苦荞麦蛋白质抗疲劳功能的研究[D]. 无锡: 江南大学, 2004.

[11]黄晓钰, 刘邻渭. 食品化学综合实验[M]. 北京: 中国农业大学出版社, 2002.

[12]LOWRY O H, ROSEBROUGH N J, FARR A L, et al. 福林酚试剂法测定蛋白质[J]. 食品与药品, 2011, 13(3): 147-151.

[13]马勇, 张丽娜, 齐凤元, 等. 榛子蛋白质提取及功能特性研究[J]. 食品科学, 2008, 29(8): 318-322.

[14]郭尧君. 蛋白质电泳实验技术[M]. 北京: 科学出版社, 2006: 92-118.

[15]LABUCKAS D O, MAESTRI D M, PERELLO M, et al. Phenolics from walnut (Juglans regiaL.) kernels: antioxidant activity and interactions with proteins[J]. Food Chemistry, 2008, 107(2): 607-612.

Extraction and SDS-PAGE Analysis of Alkali-Soluble Proteins fromJuglans mandshuricaMaxim Kernels

YU Yang-yang，BAO Yi-hong*
(School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

The extraction of alkali-soluble proteins fromJuglans mandshuricaMaxim kernel waste left over after oil extraction with supercritical carbon dioxide was optimized using one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. The effects of NaOH concentration, material-to-solvent ratio, temperature and extraction time on the extraction yield of protein. It was found that the highest extraction yield of protein, 88.05%, was obtained after 1.5 h of extraction with 0.02 mol/L NaOH solution at a material-to-solvent ratio of 1:30 and 50 ℃. The isoelectric point of the extract obtained under these conditions was measured to be 4.5. SDS-PAGE analysis showed that the molecular weight distribution of alkali-soluble proteins fromJuglans mandshuricaMaxim kernels was mainly 100, 60, 36 kD and 20 kD.

Juglans mandshuricaMaxim；alkali-soluble protein；extraction；SDS-PAGE；molecular weight

TS201.1

A

1002-6630(2012)18-0010-04

2011-07-09

中央高校基金项目(LD09C14)

于阳阳(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为功能性食品及植物资源深加工与利用。

E-mail：yuyangyang.1986@163.com

*通信作者：包怡红(1970—)，女，教授，博士，研究方向为天然产物生物转化、功能性食品。E-mail：baoyihong@163.com