一株致病性奇异变形杆菌的分离与鉴定

曲信芹 穆晓惠 李甜甜

（扬州大学兽医学院 江苏 扬州 225009）

变形杆菌（proteusbacillus vulgaris）是人和动物的寄生菌和病原菌。广泛分布在自然界中，如土壤、水、垃圾、腐败有机物及人或动物的肠道内。变形杆菌属于肠杆菌科，包括普通变形杆菌、奇异变形杆菌、莫根变形杆菌、雷极变形杆菌和无恒变形杆菌[1]。变形杆菌呈明显的多形性，有球形和丝状形，为周鞭毛菌，运动活泼。有菌毛，可粘附于植物和真菌细菌表面，但不吸附动物组织细胞和红细胞。变形杆菌为条件致病菌，多为继发感染，当机体抵抗力下降时，可引起人及动物的创伤感染、膀胱炎、尿道炎、败血症、食物中毒等，一般健康人群带菌率为1.3%～10.4%[2]。奇异变形杆菌引起的感染有日益增长的趋势，在美国，医院内感染率约为3%[3]。因此，快速准确地做出诊断，对致病性变形杆菌的防控有重要的意义。本试验采用传统的病原学方法及16S rDNA测序技术结合起来进行菌株的鉴定，从临床采集的病料中分离出一株致病性奇异变形杆菌。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

病料来自于江苏某规模化猪场，无菌取某猪的肺脏、肺门淋巴结作为待检材料。

1.2 培养基

试验所用培养基为普通营养琼脂平板、普通营养肉汤、麦康凯琼脂平板、血琼脂平板等按常规方法配制。

1.3 细菌学鉴定

1.3.1 细菌的分离培养 将无菌采集的病猪肺及肺门淋巴结分别接种于普通营养琼脂平板上，分别在有氧和厌氧条件下37℃培养24h，挑去优势菌落再分别接种于以上四种培养基直至得到菌落形态和镜检菌体形态一致的纯培养物。

1.3.2 细菌形态观察 将纯培养物按常规方法[4]进行革兰氏染色、显微镜观察。

1.3.3 生化鉴定 将培养24h的菌液按常量接种于生化微量鉴定管内，37℃培养，观察并记录结果。

1.3.4 药敏试验 采用标准的抗生素纸片法[5]，按2003年美国NCCLS（美国国立临床实验室标准化委员会）药敏试验法规进行。

1.3.5 16SrDNA的扩增及序列测定 从平板上挑取少许单菌落，移入LB液体培养基扩大培养，取1ml新鲜菌液，离心收集菌体，用超纯水重悬，煮沸冰浴后离心，其上清即为细菌的DNA。然后按照PCR扩增细菌16SrDNA的试剂盒（购自Takara公司）将该菌的16SrDNA前500bp进行PCR扩增，16SrDNA的前500 bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，进行DNA测序时一个测序反应即可测通，是一种较为经济便捷的16SrDNA鉴定方法。反应产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，鉴定正确后根据胶回收试剂盒的操作说明进行纯化，然后送上海生工测序。

2 结果与分析

2.1 细菌的培养特性

该分离菌在有氧和厌氧条件下均能生长，打开平皿时具有腐败气味。在普通营养琼脂平板上和血琼脂平板上，菌落呈圆形，半透明的呈薄膜扩散状生长，对光观察，菌落周围呈淡蓝色，血平板上不产生溶血；在麦康凯上长出均匀圆形、扁平、半透明的单个无色菌落；在普通营养肉汤中，培养基混浊液面可见菌膜，管底有少量沉淀。

2.2 细菌形态

经革兰氏染色后镜检可观察到，该分离菌为革兰氏阴性，两端钝圆，呈单个或成对的球状、球杆状、长丝状等多形态的杆菌。

2.3 生化特性

表1 分离菌的生化反应结果

2.4 药物敏感试验

分离菌对庆大霉素，新霉素，四环素，氯霉素，卡那霉素，链霉素，氨苄霉素等多种抗生素均不敏感，仅对阿米卡星敏感，显示多重耐药性。

根据以上该菌的形态，培养和生化特性及药敏试验结果，可初步判定该菌为奇异变形杆菌。

2.5 16SrDNA扩增结果及序列分析

图1 分离菌16SrDNA前500bpPCR扩增的结果1为阴性对照；2为该分离菌；3为100bpDNA Ladder Maker。

将这株菌的16SrDNA序列测定结果提交到GenBank，与GenBank中相关序列的BLAST比较，结果表明与奇异变形杆菌菌种的同源性高达99%。可判定此分离菌株为奇异变形杆菌。

3 讨论

奇异变形杆菌广泛分布于自然界可以通过消化道、呼吸道等途径传播，近年来不断有猪群爆发流行奇异变形杆菌的报道，该病已成为危害我国养猪业的一种新的细菌性传染病。并且还可引起人类的原发性或继发性感染，造成人类食物中毒，其作为人畜共患传染病病原，应引起高度重视。细菌培养是临床鉴定细菌的传统方法，而本试验应用传统方法和16SrDNA序列分析检测奇异变形杆菌相结合的技术，更加快速、简便，为该病的诊断提供了有效的途径。疫病的发生与机体的抵抗力密切相关，预防该病的关键是加强猪群的饲养管理，增强机体的防御能力。