北京某地区奶牛隐性乳房炎病原菌的分离鉴定及药敏试验

曹授俊 蔡泽川 （北京农业职业学院 北京 房山 102442）

姜小平 （北京市房山区动物疫病预防控制中心）

奶牛乳房炎是指奶牛的乳房受到了物理、化学、微生物等因素刺激所引起的一种炎症，表现为乳汁发生理化性质和细胞学性质的变化、乳腺组织发生病理学变化等。该病是奶牛的常发病之一，可引起奶牛产奶量下降、奶品质降低、奶牛过早淘汰等[1]。发病奶牛的乳汁中所含有病原微生物及其毒素和治疗后的药物残留等，对人类健康危害极大[2]。目前已知的奶牛乳房炎的致病性微生物已超过150种，其中包括球菌、杆菌、支原体、真菌、酵母菌和病毒等[3]。大部分是由细菌感染引起的，如革兰氏阳性的无乳链球菌、金黄色葡萄球菌等，规模化养殖场中大肠埃希氏菌等革兰氏阴性菌的感染也很普遍[3]。本试验对北京市某区的7个奶牛场进行了隐性乳房炎普查、病原细菌分离鉴定和主要病原菌的体外药敏试验，对该区奶牛隐性乳房炎的防控提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 BMT检测试剂由北京市奶牛公司提供；鲜血营养琼脂培养基、普通营养琼脂培养基、却甫曼琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、细菌生化微量鉴定管和药敏纸片购自北京吉普腾生物技术有限公司。

1.2 隐性乳房炎的普查 用BMT检测试剂对北京市某区的7个奶牛场的1560头泌乳奶牛（无临床型乳房炎症状）进行隐性乳房炎普查。收集奶样时，先用高锰酸钾清洗乳房，弃去头3把奶，然后以无菌操作方法挤出约10ml奶样于灭菌试管中。无菌取出2ml于诊断盘上，在每一个托盘中加入2mlBMT检测试剂，摇匀，30s后观察结果。根据反应现象依照BMT判定标准（表1）进行判断。将阳性乳样标明牛号和日期后，随即带回实验室进行病原菌的分离鉴定。

表1 BMT法检测隐性乳房炎的判断标准 （万/ml）

1.3 病原菌的分离鉴定 将隐性乳房炎阳性乳样摇匀后，无菌取适量的试管中部乳样，涂布于鲜血平板琼脂上，37℃培养24～48h，观察细菌的生长情况及其菌落特征。对不同形态的菌落进行挑菌纯培养后，涂片染色镜检[4]。根据菌体形态和染色特性，初步判定细菌类属，然后分别进行培养特性和生理生化鉴定。

1.4 主要病原菌的药敏试验 采用药敏纸片扩散法对主要病原菌进行药物敏感性试验，即将分离鉴定到的主要病原菌分别均匀涂布于鲜血琼脂平板上，然后均匀贴药敏纸片于其上，置37℃恒温箱培养24h，测量抑菌圈直径，进行抑菌效果判定。

2 结果与分析

2.1 隐性乳房炎 普查该区7个奶牛场共有奶牛存栏2830头，其中检测泌乳奶牛1560头，采用BMT检测试剂对其乳样进行隐性乳房炎的排查，结果显示阳性乳样343份（头），阳性率为21.9%。结果见表2。2.2 隐性乳房炎的乳汁中细菌分离鉴定的结果 随机选取隐性乳房炎阳性乳样40份，涂布在鲜血营养琼脂平板上，37℃培养24～48h后，结果每份乳样均有细菌菌落的存在，细菌检出率为100%。在不同培养基上主要有3类不同的菌落，对这三类菌落进行革兰氏染色，并于不同培养基上进行分离培养，结果见表3。

表2 奶牛隐性乳房炎感染情况 （头、%）

对第一类细菌进行兔血浆凝固酶试验、过氧化氢酶试验、三糖铁试验、0/F试验等；对第二类细菌进行CAMP试验、溶血试验、七叶苷水解试验、美蓝牛乳试验、甘露醇、山梨醇、血清菊糖发酵试验等；对第三类细菌进行尿素酶试验、糖类发酵试验、枸橼酸盐利用试验、明胶液化试验等[5]。经以上生化鉴定，结果见表4。

从表4中可看出，在40份隐性乳房炎阳性乳样中，共分离出细菌87株，其中金黄色葡萄球菌22株（25.4%）、表皮葡萄球菌11株（12.6%）、腐生葡萄球菌12株（13.8%）、无乳链球菌11株（12.6%）、停乳链球菌6株（6.9%）、乳房链球菌4株（4.7%）、粪链球菌1株（1.1%）、大肠杆菌14株（16%）及其他菌6株（6.9%）。由此可见，引起该地区奶牛隐性乳房炎的主要致病菌为革兰氏阳性球菌，特别是葡萄球菌属的金黄色葡萄球菌及链球菌。还有相当一部分革兰氏阴性的大肠杆菌。

表3 三类不同菌落在培养基上的生长性状

表4 隐性乳房炎病原菌的分离鉴定结果

2.3 药敏试验 采用药敏纸片琼脂扩散法对主要病原菌进行药物敏感性试验，观察7种主要病原球菌对7种不同抗生素的敏感性（测量其抑菌圈直径），结果见表5。

表5 分离细菌药敏试验结果（抑菌圈直径） （mm）

药敏试验结果显示，对葡萄球菌属致病菌，头孢噻呋钠、氟哌酸、头孢拉定以及庆大霉素的抑菌效果较好，卡那霉素和新霉素亦有抑菌效果；对链球菌属致病菌，头孢噻呋钠、氟哌酸、头孢拉定、庆大霉素、卡那霉素和新霉素的抑菌效果较好，而其他抗生素的抑菌效果不理想。

3 讨论

（1）本试验采用BMT检测试剂对北京某区7个奶牛场的1560头泌乳奶牛进行隐性乳房炎调查，结果发现隐性乳房炎的发病率约为22%。经调查发现，隐性乳房炎感染率的高低与饲养管理、环境卫生条件、病原菌致病力强弱等因素有直接的关系。饲养管理较好的两个牛场检出隐性乳房炎阳性数和强阳性数均比较少，而饲养管理较差的牛场，不仅检出率高，阳性数与强阳性数也相对较高。由此可见，加强奶牛饲养管理，保持环境卫生清洁，消除环境因素影响，对预防和控制奶牛隐性乳房炎的发生与流行有积极的意义。（2）引起奶牛发生隐性乳房炎的病原细菌很多。本试验对北京某区7个奶牛场的40份隐性乳房炎乳样进行细菌的分离鉴定，共检出87株，主要是革兰氏阳性球菌，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和大肠杆菌等，这与吴国娟等[9]报道的结果基本一致，说明北京地区奶牛隐性乳房炎致病菌中的细菌种类变化不大，个别牛场出现的差异，可能与该奶牛场的卫生条件和环境因素有关。（3）控制奶牛隐性乳房炎，大多奶牛场都以应用抗生素为主。从本次药敏试验结果来看，头孢噻呋钠、氟哌酸、头孢拉定、庆大霉素、卡那霉素和新霉素等药物对隐性乳房炎的主要致病菌具有良好的抑菌效果，但在生产中常用的抗生素如青霉素类、链霉素等对该致病菌己产生比较强的耐药性。头孢噻呋钠在临床上使用治疗奶牛隐性乳房炎，具有很好的抑菌效果，但价格昂贵，尤其个体养牛户常负担不起。（4）随着抗菌药物在大量使用，耐药菌株也越来越多，使得药物疗效下降，同时，抗菌药物在牛奶中大量残留直接影响人类健康。因此，使用中药防治[10]奶牛乳房炎，如使用公英散、炎康注射液等中药制剂，能调节奶牛全身机能，提高机体免疫力，尤其对奶牛隐性乳房炎有明显的治疗作用。