欧李酸腐病病原菌鉴定及其生物学特性研究

高莹，魏少刚，谈静惠，郝晓娟，李新凤，王建明

（山西农业大学 农学院，山西 太谷030801）

欧李（Gerasus Humilis）是蔷薇科樱桃属多年生落叶小灌木，因100 g果肉中含钙达60～70 mg，高于其它水果，得名“钙果”［1］。其抗旱性极强，耐盐碱，耐贫瘠，适应性强，从20世纪80年代开始步入人工栽培的行列［2］。随着国家对生态环境建设工作的加强和对欧李研究与开发利用的不断深化，欧李将在水土保持生态环境建设中发挥重要作用［3］。随着栽培技术的日益成熟，欧李开始在我国大面积种植，病害发生也日益严重。到目前为止，对欧李病害的报道甚少［4，5］，对欧李酸腐病的病原菌鉴定、病害流行规律及防治措施等均未见报道，给该病的防治造成了一定困难。本文对欧李酸腐病的病原菌进行了鉴定和生物学特性研究，以期为该病的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 病害症状观察与病原菌分离

于2011年8月在山西省晋城市高平、泽州等地的欧李种植基地采集病果，按常规方法进行菌株分离，单孢纯化后试管保存备用。

1.2 致病性测定

取健康欧李果实，接种前用75%无水乙醇对果实进行表面消毒。将分离获得的菌株在PDA上培养7 d后，制成浓度为1×106个·mL－1的孢子悬浮液，分别采用针刺和无伤两种处理方式［6］，喷雾接种，每处理设5个重复，以无菌水为对照。接种处理完后置于25℃下保湿培养。对接种发病的欧李进行病原菌再分离［7］。

1.3 病原菌的鉴定

将科赫氏法则验证后的菌株接种在PDA平板上，于25℃下恒温培养。测定菌落生长速度，7 d后观察菌落培养性状，观察菌丝、分生孢子、分生孢子梗［8］，结合病害症状，参照《真菌鉴定手册》［9］对病原菌进行鉴定。

1.4 病原菌的生物学特性测定

1.4.1 不同温度对菌丝生长的影响

将直径6 mm的菌饼接种至PDA平板后分别置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃下培养，8 d后用十字交叉法测量菌落直径。每处理重复3次。

1.4.2 不同p H值对菌丝生长的影响

用无菌的1 mol·L－1的 Na OH 和 HCl将PDA培养基p H 值分别调至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0共9个梯度［10］，把直径6 mm菌饼分别接种到上述不同梯度p H值的PDA平板上，于25℃下恒温培养。其它同1.4.1。

1.4.3 不同光照条件对菌丝生长的影响

设置连续光照、连续黑暗、12 h光照黑暗交替3种不同光照条件［11］，光源距培养基25 c m，25℃下恒温培养。其它同1.4.1。

1.4.4 不同碳、氮源对菌丝生长的影响

以Czapek培养基为基础培养基，分别加入含碳量相同的葡萄糖、D－果糖、可溶性淀粉、D－半乳糖、乳糖替换蔗糖，以不加碳源为对照；同样以Czapek培养基为基础培养基，分别加入含碳量相同的硫酸铵、尿素、甘氨酸、L－天冬酰胺、牛肉浸膏、L－胱氨酸替换硝酸钠，以不加氮源为对照［12，13］。接种直径6 mm菌饼，25℃下恒温培养。其他同1.4.1。

2 结果与分析

2.1 病害症状观察

该病害主要发生于欧李果实生理成熟期。果实被侵染后，表面出现白色或褐色的水渍状斑点，随着病斑的扩展，病部产生致密白色霉层（图1）。后期果实腐烂变酸，大量汁液自伤口流出，进一步引起果实整体腐烂，病果带有酸臭味。

图1 欧李酸腐病的症状Fig.1 Symptom of sour rot on Gerasus Humilis

2.2 致病性测定

离体接种结果表明，3 d后针刺接种的欧李果实出现病斑，比无伤处理的早2～3 d。发病初期出现水渍状斑点，并产生白色霉层，随后病斑逐渐扩展，最终造成整个果实腐烂并散发出酸臭气味（图2）。其症状与田间自然发病情况一致。对接种发病后的病果进行再分离，得到与接种菌相同的菌株。

图2 接种5 d后欧李果实的发病症状Fig.2 Symptom of Gerasus Humilis on fruit in 5 days after inoculation

2.3 病原菌的鉴定

病原菌在PDA上于25℃下培养约8 d时铺满平板，菌丝短绒状，菌落白色，边缘整齐，表面粉状 （图3 A）。在显微镜下可观察到有横隔的菌丝，有的为二叉分枝。病原菌产孢量丰富，菌丝成熟后断裂为长筒形、末端钝圆的单个或成链状排列分生孢子（图3B），孢子大小为4.5～10μm×3.3～7.5 μm。根据《真菌鉴定手册》将该病原菌鉴定为白地霉（Geotrichum candidum）［14］。

图3 病原菌的形态特征Fig.3 Morphology of the pathogen（A：Colony morphology；B：Conidia 40×）

2.4 病原菌的生物学特性测定结果

2.4.1 温度对菌丝生长的影响

该病原菌在15～35℃温度范围内均可生长，适宜生长温度范围为20～30℃，25℃是其最适生长温度，菌丝生长最好（图4）。

图4 不同温度对菌丝生长的影响Fig.4 Effect of different temperature on mycelial growth

2.4.2 光照对菌丝生长的影响

由图5可看出，光照对欧李酸腐病病原菌菌丝生长有较大影响，12 h光暗交替条件下菌丝生长最快，8 d时可达8.4 c m，显著差异于其余两个处理，12 h光暗交替为该病原菌菌丝最适生长光照条件。

2.4.3 p H对菌丝生长的影响

该病原菌在p H值3～11间均可生长，p H值为6和7的时菌丝生长最快，8 d时菌落直径可达8.0 c m。p H为3时，菌丝生长速度明显减慢，8 d时菌落直径为6.5 c m；p H为11时，菌丝生长速度最慢，受到明显抑制，8 d时菌落直径仅为4.8 c m（图6）。

图5 光照对菌丝生长的影响Fig.5 Effect of illumimation on mycelial growth

图6 不同p H对菌丝生长的影响Fig.6 Effect of differentp Hon mycelial growth

2.4.4 不同碳、氮源对菌丝生长的影响

在供试的6种碳源中，菌丝在以葡萄糖和果糖为碳源的查氏培养基中生长最快，8 d时菌落直径分别可达7.8 c m和7.6 c m，两者无显著差异。其次为半乳糖，8 d时菌落直径可达7.1 c m。在不加碳源的培养基中菌丝生长最慢，8 d时仅4.9 c m（图7）。由图8可看出，在供试的7种氮源中，牛肉浸膏和硝酸钠为氮源以及不加氮源的培养基菌丝生长最好，8 d时菌落直径分别可达7.9 c m、7.9 c m和8.1 c m；其次为天门冬氨酸，8 d时菌落直径为7.3 c m，对硫酸铵、尿素、膀胱氨酸和甘氨酸的利用较差。以硝酸钠为氮源的培养基和CK长出的菌落稀疏，以牛肉浸膏为氮源长出的菌落茂密。

图7 不同碳源对菌丝生长的影响Fig.7 Effect of different car bon sources on mycelial growth

图8 不同氮源对菌丝生长的影响Fig.8 Effect of different nitrogen sources on mycelial growth

3 结论与讨论

根据欧李酸腐病的症状、病原菌形态学特征以及致病性测定的结果，将欧李酸腐病的病原菌鉴定为白地霉（Geotrichum candidum）。欧李酸腐病在国内属首次报道。该病原菌最适生长温度25℃，最适光照条件为12 h光暗交替，最适p H为6～7，其中温度和光照条件的研究结果与蔡学清等［15］的结果相似，但是与其最适p H为8～10的研究结果有所不同，可能与欧李果实偏酸有关。欧李酸腐病菌的生长对温度、p H、光照和氮源的要求不严格，在较大范围内都能生长，说明该病原菌有较好的环境适应能力。该病原菌在不加任何氮源的和以硝酸钠为氮源Czapek培养基上生长快却表面稀疏，在以牛肉浸膏为氮源的培养基上长势最好，可能成分复杂的有机氮源更加利于该病原菌的营养生长。欧李果实中果糖含量最高，其次为蔗糖和葡萄糖。最适宜该病原菌生长的碳源为果糖和葡萄糖，这与果实成熟期果糖和葡萄糖含量达最大值一致［16］。

酸腐病一般发生于果实的成熟期，由于各种原因造成的果皮损伤更容易使病原菌侵入，是果实贮运时常见却难防治的病害［17，18］。欧李酸腐的发生会使欧李果实腐烂，且易侵染，收获期可造成严重损失。欧李通常在夏秋季收获成熟果实，且在华北地区欧李果熟期较长［19］，此时的温度较有利于欧李酸腐病菌生长，给欧李酸腐病的防治带来了一定的难度。对欧李酸腐病的病原菌鉴定及生物学特性的研究尚属首次，本研究结果可为进一步研究和防治欧李酸腐病提供相关理论依据。

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