高效液相测定血中谷氨酰胺的研究

查登峰

·实验研究·

高效液相测定血中谷氨酰胺的研究

查登峰

目的 探讨高效液相色谱法测定血中谷氨酰胺的含量。方法 固定相反相C18(规格:0.46 mm×250 mm)，流动相为50 mmmol/L醋酸缓冲液(pH为6.5):乙腈(97.7∶2.3)，流速1.0 ml/min，柱温46℃，检测波长为254 nm，进样量取10 μl。结果 谷氨酰胺在浓度范围(0.05～2.60)μg/ml之间有良好的线性关系，r=0.9989，批间、批内变异系数分别为2.87%、2.58%，两种高低浓度的回收率分别为102.9%、97.0%。结论 本研究方法专属性强、重复性好、结果准确，为血中谷氨酰胺的含量测定提供了科学、专属的方法。

高效液相色谱法;血清;谷氨酰胺

目前有很多研究显示，谷氨酰胺(GLN)为人体中大多器官与组织所需的特殊营养物质，故亦称“基本营养素”，系肠外营养的重要成分［1］。但GLN不溶于水，遇热不稳定等，因此只能经双肽键以丙氨酸与其结合，合成稳定丙氨酰-谷氨酰胺的双肽分子，此双肽分子进入机体后可很快分解成单体的谷氨酰胺与丙氨酸，因此双肽键在人体中打开率对丙氨酰-谷氨酰胺注射液在临床上应用的药效评价是十分重要。本文笔者通过测定血中GLN浓度及血清GLN健康者的参考值，分别对丙氨酰谷氨酰胺注射液(商品名:多蒙特，四川科伦药业股份有限公司，国药准字:H20043702)和另外丙氨酰-谷胺酰胺注射液(国内某制药有限公司)，探索我院行腹部大手术患者采用经谷氨酰胺强化安全肠外营养后血清中的GLN浓度情况。

1 仪器与试药

Waters高效液相色谱仪(美国，490型紫外检测器，510型输液泵，U6K进样器，PICO-TAG色谱柱，810色谱工作站)，微孔滤膜(美国，Millipore公司)。

乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯;谷氨酰胺标准品(美国Sigma公司);异硫氰酸苯酯(美国Pierce公司);丙氨酰谷胺酰胺注射液(四川科伦药业股份有限公司);丙氨酰谷胺酰胺注射液(国内某制药有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为固定相反相C18(规格:0.46 mm×250 mm)，流动相为50 mmmol/L醋酸缓冲液(pH为6.5):乙腈(97.7∶2.3)，流速每分钟 1.0 ml，柱温 46℃，检测波长为254 nm，进样量取 10 μL。

2.2 标准溶液的制备 准确称取18.45 mg GLN标准品，以50 ml超纯水溶解混匀，即得2.5 mmmol/L GLN标准溶液，于4℃可保存。准确量取20 μLGLN标准溶液加至100 μL患者的血清中，充分混匀，即为标准血清。另外加入超纯水20 μL于100 μL血清中，充分混匀，即为标准空白血清。标准血清与标准空白血清同时超滤，取滤液，分别为标准液与标准空白液。

2.3 待测血清样本液的制备 抽取100 μL患者血清进行超滤，得无蛋白超滤液，即为待测的血清样本液。

2.4 衍生反应 分别量取加入超纯水20 μl、20 μl三乙胺及140 μl无水乙醇加入异硫氰酸苯酯中，充分混匀，即得衍生试剂，需现配现用。准确称取355 mg磷酸氢二钠，加入450 ml超纯水进行溶解，以10%磷酸-乙腈(95∶5)混合溶液调PH为7.4，加水定容至500 ml，充分混匀，即得样品稀释液，于4℃冰箱保存。分别量取20 μl处理过的血清，在真空条件下抽干，加入20 μl衍生试剂，在室温下进行反应20 min，然后再真空抽干，加入 1000 μl的样品稀释液，混匀，量取 10 μl进样。

2.5 线性关系考察 量取2.5 mmol/L GLN标准溶液，以超纯水对倍进行稀释，分别获得7个浓度:2.500、1.250、0.625、0.312、0.156、0.078 与 0.039 mmol/L，各取 20 μl，衍生和测定。横坐标为GLN浓度(C)，纵坐标为峰面积(A)，进行线性回归。结果显示GLN标准溶液在浓度范围(0.05～2.60)mmol/L之间有良好的线性关系，r=0.9989。

2.6 重复性试验 精密量取12份1.25 mmol/L GLN标准溶液，在上述色谱条件下进样，测得批间变异系数为2.87%，批内变异系数为2.58%。

2.7 干扰试验 取混合氨基酸标样(不含GLN)，分为两份，其中一份加至350 μmol/L的GLN中，两份均按照上述方法处理并进样。结果显示GLN峰保留时间为11.09 min，其邻近2个峰分别为β-丙氨酸(保留时间12.33 min)、甘氨酸(保留时间10.02 min)，GLN峰位置没有受到任何氨基酸及其他杂峰干扰。

2.8 稳定性试验 分别在衍生0、2、4、6 h精密吸取同一血清标本10 μl，进样测定，结果显示RSD=0.020%，说明血清标本在室温6 h内的稳定性佳。

2.9 回收试验 分别取2份健康人群的血清，均按照找上述方法测定GLN浓度，分别获得结果为597、608 mmol/L，再分别加入1.25、0.156 mmol/L两种高低浓度GLN标准溶液，各10 μl，混匀，依法测定GLN的浓度，计算回收率。结果显示两种高低浓度的回收率分别为102.9%、97.0%。

3 讨论

2001年国外已有研究采用高效液相色谱法测定GLN，其在GLN衍生后以磷酸缓冲液-甲醇行单泵恒定溶剂的等梯度洗脱［2］。近年来国内学者认为采用单泵恒溶剂洗脱，GLN与杂峰不能彻底地分离，故以双泵双流动相行梯度洗脱［3］。但是梯度洗脱需配置2个梯度混合器与输液泵。而事实上采用高效液相色谱法分离单一组分，其能否与杂峰彻底分开很大程度取决于能否获得流动相中水相(缓冲液)和有机相(乙腈、甲醇)的最佳比例。本研究结果显示，GLN在乙腈浓度为2.3%时分离效果最好，采用单泵恒溶剂洗脱即与其他杂峰完全分离，分析时间仅需15 min，同时峰形佳。

本研究在处理样品时运用离心超滤法除去血中蛋白质。有文献指出取血浆0.4 ml超滤，得20 μl超滤液即可行衍生与色谱分析［4］。本文笔者认为外标法因受到超滤膜吸附与残留影响，超滤血浆后体积发生变化，此时测得的GLN含量与实际浓度必然具有一定的差异。本研究为了保持实验条件一致性，消除上述误差，故取同一血清分为标准血清与标准空白血清2份，均与相同的条件下超滤、衍生反应及色谱分析，以标准血清与标准空白血清峰面积之差计算结果，即作为标准品实际峰面积来计算待测血中GLN含量，使结果更可靠、准确。

本研究采用PITC作为GLN的衍生剂，因其在实验过程中不受时间的限制［5］，而衍生产物于室温条件下保存6 h后结果也不存在显著的差异，于检测波长254nm处具有特征峰吸收，且无其他杂峰的干扰，获得了满意的结果。

近年来临床上采用谷氨酰胺强化的完全肠外营养来对危重患者及术后患者进行治疗与护理。本临床试验也表明，实验组患者于手术前后连续7 d采用丙氨酰-谷胺酰胺注射液(多蒙特，四川科伦药业股份有限公司)的肠外营养后，血中GLN浓度明显高于对照组采用的丙氨酰-谷胺酰胺注射液(国内某制药有限公司)，两者差异具有统计学意义(P＜0.05)。本研究方法专属性强、重复性好、结果准确，为血中谷氨酰胺的含量测定提供了科学、专属的方法。

［1］ Poindexter BB，Ehrenkranz RA，Stoll BJ，et al.Parenteral glutamine supplementation does not reduce the risk of mortality or lateonset sepsis in extremely low birth weight infants.Pediatrics，2004，113(5):1209-15.

［2］ Gu Y，Wu ZH，Xie JX，et al.Effects of growth hormone(rhGH)and glutamine supplemented parenteral nutrition on intestinal adaptation in short bowel rats.Clin Nutr，2001，20(2):159-66.

［3］ Hasebe M，Suzuki H，Mori E，et al.Glutamate in enteral nutrition:can glutamate replace glutamine in supplementation to enteral nutrition in burned rats?.JPEN J Parenter Enteral Nutr，1999，23(5 Suppl):S78-82.

［4］ Neu J，DeMarco V，Weiss M.Glutamine supplementation in lowbirth-weight infants:mechanisms of action.JPEN J Parenter Enteral Nutr，1999，23(5 Suppl):S49-51.

［5］ Lai YN，Yeh SL，Lin MT，et al.Glutamine supplementation enhances mucosal immunity in rats with Gut-Derived sepsis.Nutrition，2004，20(3):286-91.

333000江西省景德镇市第二人民医院药剂科

2.10 血清GLN的参考值测定 取30份健康人群的空腹血清标本，均按照上述方法测定GLN浓度，获得结果(616.8±67.9)μmol/L。

2.11 临床试验 选取我院行腹部大手术患者共30例，随机分为实验组与对照组，每组各15例。其中实验组患者于术前3天始采用用丙氨酰-谷胺酰胺注射液(多蒙特，四川科伦药业股份有限公司)0.5 g/kg，连续治疗6 d;而对照组患者采用丙氨酰-谷胺酰胺注射液(国内某制药有限公司)，用法同实验组。两组患者分别在术前3 d及术后3、7 d测定GLN浓度(见表1)。

两组患者用药前后血清中谷氨酰胺浓度比较见表1。结果显示，术后7 d实验组患者血清中的谷氨酰胺浓度明显高于对照组患者约10%，两者差异具有统计学意义(P＜0.05)。

表1 两组患者用药前后血清中谷氨酰胺浓度比较(±s，μmmol/L)

注:与对照组比较，*P＜0.05

组别 例数 术前3 d 术后3 d 术后7 d实验组 15 603±70 500±43 608±59*对照组15 605±61 482±39 552±51