不同的二价阳离子（Ca2+、Mg2+、Zn2+）对大豆蛋白分级效果的影响

郑二丽，杨晓泉，吴娜娜

（华南理工大学轻工与食品学院食物蛋白工程研究所，广东广州 510640)

不同的二价阳离子（Ca2+、Mg2+、Zn2+）对大豆蛋白分级效果的影响

郑二丽，杨晓泉*，吴娜娜

（华南理工大学轻工与食品学院食物蛋白工程研究所，广东广州 510640)

向脱脂豆浆中加入不同的二价阳离子（Ca2+、Mg2+、Zn2+），考察它们在大豆蛋白分级过程中对去除亲脂性蛋白的效果。结果显示，三种离子的加入均降低了样品的蛋白提取率，同时总脂含量也有所减少，根据SDS-PAGE分析，在一定的浓度范围内，所减少的蛋白组分可能是与脂紧密结合的组分（仅限CaCl2及MgCl2的添加）；同浓度的CaCl2处理所得样品总脂含量减少最多，且其蛋白提取率稍低于MgCl2处理所得样品，但高于ZnCl2处理所得样品，结合TLC分析，表明Ca2+去除亲脂性蛋白的作用效果最好，以此作为沉淀剂的最佳分级条件为：在pH7.0下添加10mmol/L的CaCl2，所得样品蛋白提取率降低了33%，但蛋白含量由88.45%增加到92.58%（干基），同时总脂含量由4.83%降低到2.01%。

二价阳离子，大豆蛋白，亲脂性蛋白，总脂含量

大豆种子蛋白包含清蛋白与球蛋白，而球蛋白是主要的储存蛋白，根据电泳图谱分析，储存蛋白主要由7S球蛋白与11S球蛋白组成，它们不仅价格低廉、营养丰富，并且还具有较高的功能特性，如7S蛋白具有较好的水溶解性、乳化能力和乳化稳定性，而11S蛋白具有更好的凝胶硬度、凝胶拉伸强度及凝胶保水性，这些特性提高了大豆蛋白在食品加工中的作用，同时也增大了其在食品领域的应用。近几年也有学者提出大豆储存蛋白中不仅含有7S、11S，还含有一种结合有磷脂的亲脂性蛋白（LP）[1]。这种亲脂性蛋白是一种膜蛋白，一般来说膜蛋白是一种高度疏水及亲油的蛋白，这无疑会影响蛋白质的溶解性，同时还会影响蛋白的乳化性及起泡性[2]。LP是大豆蛋白中与磷脂、糖脂等极性脂相结合的蛋白质的总称，有学者报道蛋白中产生这种不良的风味主要是因为在脱脂豆粉中还存在一些极性脂[3-4]。磷脂自动氧化生成的一些小分子物质正是影响大豆风味的挥发性成分，这表明LP的存在还会影响蛋白的风味及色泽。因此，从大豆蛋白中除去LP即能提高蛋白的功能特性，还可改善蛋白风味，提高其利用率。1998年Samoto等[5]在酸性条件下（pH2.8）向脱脂大豆浆中各加入30mmol/L的Na2SO4和CaCl2，超速离心（10000×g，10min），可有效地提取出油体结合蛋白较多的SPI及油体结合蛋白较少的SPI，这种分级的方法需要较高的离心力，限制了工业化的生产。2007年Samoto等通过三步法从豆粕中分离出LP组分，进而改善了大豆分离蛋白风味[1]。当溶液的pH大于蛋白质的等电点时，钙在水相体系中能与大豆蛋白结合而导致后者发生聚集。而钙、镁、锌同属于碱土金属，因此可以推测，镁盐与锌盐也可作为大豆蛋白的沉淀剂[6]。Yuan等[7]人认为可能由于7S与11S的表面电荷密度不同，沉淀这两种组分所需的阳离子的量不同，因此可以通过调节pH及离子的添加量分离这两种组分。LP作为新提出的蛋白组分，电荷密度与其他两种组分也会不同，因此可以通过二价阳离子的沉淀作用，分离出LP组分，以改善大豆蛋白的风味及功能性质。本实验主要是通过分析二价阳离子处理所得样品在蛋白提取率、蛋白含量、总脂含量及SDS-PAGE电泳图谱的不同，来比较钙、镁、锌三种离子对分离LP组分的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

低温脱脂豆粕 山东禹王有限公司，蛋白质含量53.8%（w/w，干基），含水量8.8%，脂含量5.6%（w/w，干基），氮溶指数85.4%，将其于4℃保存以备用。

DYF-500摇摆式高压万能粉碎机 温岭市林大机械有限公司；THZ-82水浴恒温振荡器 江苏金坛宏华仪器厂；DELTAT-24/LSC冷冻干燥机 德国Christ公司；CR22G高速冷冻离心机 日本Hitach公司；ECP3000三恒电泳仪 北京市六一仪器厂；RapidNCube快速定氮仪 德国Elementrar公司；SevenEasypH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；P-1薄层层析展开缸 上海信谊仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 普通酸沉蛋白的提取 低温脱脂豆粕粉碎后，过60目筛，取40g以上处理所得的豆粉添加400mL水，用2mol/L的NaOH调pH8.0，提取液于常温下搅拌2h，然后15℃、4000×g下离心10min，乳液用2mol/L的HCl将pH调至4.5，搅拌30min后，15℃、2000×g下离心10min，沉淀即为酸沉大豆蛋白（APP），用去离子水重新分散并调节pH至7.5，经过透析后进行冷冻干燥，置于4℃密封保存备用，以此方法提取的分离蛋白为对照蛋白。

1.2.2 改进的提取分离蛋白方法 豆粉以1∶10的比例加水后，用2mol/L的NaOH调pH7.0～8.0，搅拌1h后分别加入0～30mmol/L的MgCl2、CaCl2、ZnCl2，于50℃下水浴1h，取出迅速冷却，回调pH至起始值，以下步骤同上1.2.1，所得蛋白不同盐离子处理所得分离蛋白。

1.2.3 蛋白质含量和提取率的测定 取适量样品于130℃下干燥3h[8]，测定水分含量。采用Jung S方法测定各蛋白组分的含氮量[9]，蛋白质含量=含氮量×6.25。

根据所得各蛋白组分的蛋白质含量、脱脂豆粉的质量和总蛋白质含量，可得各组分的蛋白质提取率，即蛋白质提取率=[所得样品的质量×（1-水分含量）×其蛋白含量]/[原脱脂豆粉质量×（1-水分含量）×豆粉中蛋白含量]×100%。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 根据

Laemmli的方法[10]进行SDS-PAGE分析，浓缩胶和分离胶浓度分别为12.5%和3%（w/V），考马斯亮蓝（CBB）R250染色。参照Mujoo等[11]的方法辨别11S、7S及LP各亚基，11S、7S及LP组分的纯度为各自亚基的密度之和与它们三个总密度的比值。

1.2.5 总脂的测定 参考国标GB2906-1982[12]采用索氏抽提法测定各组分的极性脂含量，以氯仿∶甲醇（体积比1∶2）为抽提剂。其中：极性脂含量（干基）=极性脂类质量/[试样质量×（1-水分含量）]×100%

1.2.6 TLC分析 薄层层析方法具体操作如下：取1.0g冻干的样品加入10mL氯仿/甲醇（1∶2，V/V）的混合液，在50℃下萃取1h，将萃取液烘干，再加入1mL氯仿/甲醇（1∶2，V/V）的混合液，然后取10μL点到硅胶H薄层板上，用氯仿/甲醇/冰醋酸/水（85∶15∶10∶3，V/V）混合液作为展开剂，展开，取出，晾干，喷10%的硫酸溶液，在105℃下加热至斑点显色清晰[2]。

1.2.7 统计分析 所有实验重复三次。通过方差分析（ANOVA）和线性回归模式（GLM）进行数据处理。以5%最小置信度（LSD）进行数据计算，并使用SAS系统进行均值比较（Version 13，SAS Institute Inc.，Cary，N.C.，U.S.A.）。

2 结果与分析

2.1 蛋白质提取率及蛋白含量的分析

添加不同的二价阳离子（Ca2+、Mg2+、Zn2+）对所得样品的蛋白提取率及蛋白含量的影响如表1所示。由表可知，由二价阳离子处理所得样品的提取率都有所降低（对比APP），其中以锌离子处理的样品下降幅度最大，其次是钙离子。此现象与A.G.Appu Rao等[13]的研究结果类似，他们用三种离子沉淀7S，钙离子可以沉淀40%，镁离子沉淀10%，而锌离子则沉淀90%的7S，这表明锌离子与蛋白的结合能力最强。此外，蛋白的提取率随着阳离子的增加而逐渐降低，尤其是锌离子，在添加5mmol/L时提取率就降低了1/3（相对APP），并且在pH7.0时提取率受阳离子浓度的影响最大，这主要是因为pH影响着阳离子与蛋白质的结合。总的来说，蛋白提取率的降低是由于部分蛋白与阳离子结合沉淀到豆渣中去，被沉淀的蛋白组分还需进一步分析。

蛋白含量的变化也存在较大的差异，从表中可看出，在低离子浓度时（≤5mmol/L）蛋白含量都有所增加（与APP相比），随后蛋白含量随着ZnCl2的增加而有所降低，但随着CaCl2、MgCl2的增加反而增加，这进一步说明了锌与蛋白的结合能力要高于其他两种离子，较少量的锌盐就可以沉淀较多的蛋白到豆渣中去，使样品中蛋白含量降低，而钙、镁与蛋白的结合性远低于锌，在沉淀部分蛋白的同时更沉淀了较多的其他小分子物质，从而提高了样品中蛋白质的含量。

2.2 总脂含量的分析

表2为二价阳离子对样品中总脂含量变化的影响，表中显示，仅热处理（0mmol/L）就降低了蛋白中总脂的含量（对比0mmol/L与APP）；随着盐的增加，总脂含量在逐渐降低，但添加Ca2+对脂含量影响最大，其次是Mg2+，结合蛋白提取率及蛋白含量的变化，可说明这两种离子沉淀的蛋白可能是与脂紧密结合的组分，即为Samoto等[2]提出的亲脂性蛋白（LP），这种蛋白与磷脂等极性脂紧密结合。Zn2+的添加对样品中总脂含量的影响不是很大，但表1中的蛋白提取率降低幅度最大，这表明Zn2+没有选择性地沉淀LP组分，产生这种现象的原因可能是由于Zn2+的离子半径及配位构型与其他两种离子的不同[14-16]，导致与蛋白质的结合强度不同。

表1 不同的pH下添加不同的二价阳离子对所得样品蛋白提取率及蛋白含量的影响Table 1 Effect of different pH and divalent cations on protein recovery rate and protein content

表2 不同的pH条件下添加不同的二价阳离子对样品中总脂含量的影响Table2 EffectofdifferentpH anddivalentcationsonlipidcontent

2.3 SDS-PAGE电泳分析

图1 不同的pH及添加不同阳离子分级所得的分离蛋白的SDS-PAGE图谱Fig.1 SDS-PAGE of the protein samples obtained with different pH and divalent cations

添加不同二价阳离子处理后所得分离蛋白样品电泳图谱存在较大的差异，图A为在不同的pH条件下添加不同浓度的CaCl2所得分离蛋白的电泳图，对比APP中P34条带，添加CaCl2后它的含量有所减少，有文献表述P34是与极性脂紧密结合的蛋白组分[17]，通常也被称为脂结合蛋白。添加CaCl2的量不同，对所得分离蛋白各亚基组成的影响程度不同，在低浓度时（pH7.0时≤10mmol/L，pH7.5时≤15mmol/L及pH8.0时≤20mmol/L），除了P34条带的含量较少外，7S与11S各亚基没有很大的变化，这说明此浓度范围内蛋白提取率的降低可能是脂结合蛋白；超过一定的浓度范围后，7S各亚基的含量会逐渐增加，而11S各亚基含量在减少，这说明开始有11S组分沉淀到豆渣中，这与Yuan等[7]的研究结果类似，Yuan等提出沉淀1mol的7S比沉淀1mol的11S所需要钙离子的量大得多，原因可能是因为7S分子量比11S小，且表面电荷密度比11S的多。综上可得，Ca2+所沉淀三种组分的顺序为：亲脂性蛋白＞11S＞7S，具体原理还需进一步探讨。

B图为添加ZnCl2所得分离蛋白的电泳图谱，由图可看出，各条带之间蛋白组分的亚基没有差异，这进一步表明Zn2+与蛋白的结合与其它两种离子不同，可能是Zn2+与蛋白的结合性太强，很少量的Zn2+即可沉淀各蛋白组分。

2.4 TLC分析

本实验中薄层层析以氯仿∶甲醇（1∶2，V/V）为萃取溶剂萃取极性脂，以氯仿/甲醇/冰醋酸/水（85∶15∶10∶3，V/V）混合液为展开剂，分析样品中极性脂的变化。图2（左）中CaCl2的添加明显地减少了极性脂的含量，尤其是带2（pH7.0、10mmol/L CaCl2），且随着pH的增加样品中色谱条带逐渐清晰，这说明极性脂的量在增加，与2.2中总脂含量变化趋势一致。结合蛋白提取率及总脂含量的分析，可得出结论，在低CaCl2浓度下，沉淀的组分可能是与极性脂相结合的蛋白组分，且pH严重影响着Ca2+与蛋白的结合；图2（右）为经过MgCl2处理所得分离蛋白的色谱图，图中表明极性脂的含量是有所减少（相比APP），但1′～3′带没很大的变化，这说明pH对Mg2+与蛋白的结合性影响没有Ca2+与蛋白的结合性大，随着Mg2+的增加色谱变化没有Ca2+的显著（文中未显示），可能是Mg2+与蛋白的结合性弱所致；Zn2+处理所得分离蛋白的色谱图（未列出）与电泳图谱类似，所有条带均无变化，可能是Zn2+在沉淀脂结合蛋白的同时也沉淀了7S与11S组分，使所得分离蛋白中极性脂的含量不受锌离子的影响。

图2 不同方法处理所得的大豆蛋白的TLC图谱Fig.2 TLC of lipids from protein fractions with different treatment

3 结论

CaCl2、MgCl2、ZnCl2的添加均降低了蛋白得率（与APP相比），同时也降低了总脂含量，结果表明，经过二价阳离子处理使脂类沉淀到豆渣中去，这样可以改善分离蛋白的一些功能特性。但由于它们与蛋白的结合强度不同，导致所降低的程度不同，将蛋白得率与总脂含量结合考虑，可得添加Ca2+去除亲脂性蛋白的作用效果最好，Mg2+次之，Zn2+的作用效果最小。

通过SDS-PAGE显示，在一定的浓度范围内，添加CaCl2、MgCl2可以沉淀出亲脂性蛋白，此后开始有11S被沉淀下来，最后是7S，但ZnCl2的沉淀亲脂性蛋白的效果不是很明显。

以CaCl2作为沉淀剂去除亲脂性蛋白，结合pH的影响，较优的分离条件为：pH7.0、50℃加热1h的同时加入10mmol/L的CaCl2。用此条件所得样品的蛋白提取率为APP的2/3，且总脂含量降低了45%。

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Effect of different divalent cations（Ca2+，Mg2+，Zn2+）on fractionation of soy protein

ZHENG Er-li，YANG Xiao-quan*，WU Na-na
（Research and Development Center of Food Proteins，College of Light Industry and Food，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

Effect of different divalent cations on the removal lipophilic protein from the soy protein was compared. The results indicated that the protein recovery rates and the lipid contents were decreased using divalent cations in the fractionation process.The removed protein might be the protein fraction associated with lipids at a certain concentration of CaCl2or MgCl2.Lipid content of the sample prepared with CaCl2was reduced mostly，and the protein recovery rate was a little smaller than MgCl2treatment，but significantly higher than ZnCl2treatment.So Ca2+was the best precipitation agent which can remove lipophilic protein from the soy protein effectively.The optimized fractionation condition was pH7.0 in the presence of 10mmol/L CaCl2，and the protein recovery rate was decreased by 33%，whereas the protein content increased from 88.45%to 92.58%，and simultaneously the lipid content decreased from 4.83%to 2.01%.

divalent cations；soy protein；lipophilic protein；lipid content

TS201.2+1

A

1002-0306（2012）05-0108-05

2011－04－25 *通讯联系人

郑二丽（1986-），女，硕士研究生，研究方向：粮食、油脂与植物蛋白工程。

岭南大学粮油项目（20100529）。