GC法测定羟乙基淀粉摩尔取代度的研究

杜中海，任传杰，于 鹏，宋彦会，袁洪雨

(山东齐都药业有限公司，山东淄博255400)

羟乙基淀粉(hydroxyethyl starch，HES)为淀粉在酸性条件下水解成一定分子量后，在碱性条件下羟乙基化而成，即位于葡萄糖基上的羟基被羟乙基取代，取代后的淀粉不易被体内的淀粉酶水解，可维持较长时间的渗透压。一般而言，HES的扩容强度主要决定于体内分子量大小。体内停留时间则主要由HES的羟乙基化程度大小决定。低分子量HES扩容强度小，而高取代级HES因体内停留时间过长可能会发生凝血机制受损和体内蓄积［1］。目前，国内多采用摩根法测定羟乙基淀粉取代度，存在操作繁琐、检测误差大等问题。本文研究了GC法测定羟乙基淀粉摩尔取代度的反应条件、杂质对检测结果的影响，并与摩根法进行了比较。

1 仪器与试药

Agilent 7890A气相色谱仪，羟乙基淀粉标准品(欧洲药典委员会，Code:Y0001277)，羟乙基淀粉130/0.4(山东齐都药业有限公司，批号:110601)，碘乙烷、甲苯、氢碘酸等其他试剂均为色谱级。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:DB－624石英毛细管柱(L=60 m，∅=0.53 mm);固定相:6%氰丙基苯基聚甲基硅氧烷(膜厚3 μm);进样口温度200℃;程序升温:50℃维持4 min，以15℃·min－1升至230℃维持4 min;载气:氮气;流速:8 mL·min－1;进样体积:1 μL;分流比:1∶20;FID 检测器;检测器温度280℃;定量方法:内标法;内标物:甲苯;洗脱顺序:碘乙烷，甲苯。

2.2 系统适用性试验 内标溶液的制备:精密吸取甲苯1.0 mL，用二甲苯稀释至 200.0 mL，即得。

羟乙基淀粉标准品溶液的制备:取羟乙基淀粉标准品约50 mg精密称定，置反应瓶中，加入0.10～0.15 g己二酸，精密加入1.0 mL内标溶液和2.0 mL氢碘酸，密封。135℃下反应15 h，冷却至室温，精密称定，去掉失重超过5 mg的样品，分别吸取上清液100 μL，置进样瓶中，用1.0 mL邻二甲苯稀释，密封，摇匀，取1 μL注入气相色谱仪，测定结果见图1。

图1 羟乙基淀粉标准品GC色谱图

碘乙烷峰在6.28 min，甲苯峰在 9.294 min，无其他杂峰干扰，分离度良好。

2.3 线性关系考察 向7个反应瓶中分别加入己二酸约0.10 ～0.15 g，1.0 mL 内标溶液和 2.0 mL 氢碘酸，密封。用100 μL的定量进样器分别精密加入约 10 mg、20 mg、30 mg、40 mg、50 mg、60 mg、70 mg 碘乙烷，密封。精密量取反应后的对照溶液各1 μL注入气相色谱仪，以碘乙烷的质量(mg)为横坐标，碘乙烷与内标的峰面积比为纵坐标绘制标准曲线，见图2。

图2 对照品碘乙烷线性图谱

线性方程为Y=0.027 5X－0.002 2，线性相关系数r为0.999 9。由线性试验可知，碘乙烷浓度在 0.30～2.1 mg·mL－1范围内呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验

2.4.1 GC法测定羟基淀粉取代度 取供试品溶液，精密量取1 μL注入气相色谱仪，重复6次试验，记录色谱图，计算取代度，结果见表1。

表1 GC法精密度考察表

2.4.2 摩根法测定羟乙基淀粉取代度 摩根法检测羟乙基淀粉取代度是将羟乙基淀粉经氢碘酸水解，羟乙基转化成碘乙烷和乙烯，然后分别将二者转化成碘，进行氧化还原滴定［2］。重复测定6次，结果见表2。

表2 摩根法精密度考察表

比较上述两种方法可知:GC法检测羟乙基淀粉取代度准确度高，精密度好，而且一次可同时处理多份样品，色谱条件耐用性较强，对色谱柱要求不高。摩根法装置复杂，操作过程繁琐，且不能同时处理多批次样品，其测定误差主要来自于反应的完全程度及气体泄漏。

2.5 稳定性试验 依法制备对照品溶液，分别于室温放置0、2、4、6、8 h，精密量取 1 μL 注入气相色谱仪，记录色谱图，计算取代度，结果见表3。

表3 溶液稳定性考察表

由稳定性试验结果可知，溶液在室温放置8 h内，稳定性良好。

2.6 样品反应条件试验

2.6.1 依法制备供试品分别于 135 ℃加热 10、11、12、13、14、15、16、17 h，放冷至室温，精密称重，去掉失重超过 5 mg的样品，精密量取1 μL注入气相色谱仪，记录色谱图，结果见图3。

图3 反应时间对取代度的影响

2.6.2 依法制备供试品分别于120℃、125℃、130℃、135℃、140 ℃、145 ℃、150 ℃、155 ℃ 下加热 15 h［1］，放冷至室温，精密称重，去掉失重超过5 mg的样品，精密量取1 μL注入气相色谱仪，记录色谱图，结果见图4。

反应温度低或时间短时，反应不彻底，检测结果偏低;温度过高或反应时间过长时，反应瓶的气密性很难保证。最佳反应温度为135℃，15 h。

2.7 样品含水量及含盐量的影响 将羟乙基淀粉130/0.4样品暴露吸水后，比较同一取代度不同水分含量测定结果。向羟乙基淀粉130/0.4样品中加入一定量氯化钠，比较同一取代度不同氯化钠含量测定结果［1］，结果见表4。

图4 反应温度对取代度的影响

表4 样品含水量及含盐量对取代度的影响

结论:样品中水分含量在2% ～4%，氯化钠含量在0.5%～15%，在计算过程中扣除水分及氯化钠，对测定结果无影响。

3 讨论

GC法测定羟乙基淀粉摩尔取代度的反应条件研究中，考察了反应温度与反应时间，结果表明反应温度与反应时间对测定结果有明显影响，最佳反应条件为135℃反应15 h。

在不同检测方法测定取代度的研究中，考察了GC法与摩根法的精密度，结果表明GC法测定的精确度要高于摩根法。在杂质影响的研究中，考察了不同水分含量与氯化钠含量对测定结果的影响。结果表明水分在2%～4%，氯化钠在0.5% ～15%对测定结果无影响。通过进行检测方法的方法学试验，表明GC法简便快捷、准确度高，可作为羟乙基淀粉摩尔取代度的检测方法。

［1］Lee YC，Baaske DM，Carter JE.Determination of the molar substitution ratio of hydroxyethyl starches by gas chromatography［J］.Anal Chem，1983，55(2):334 －338.

［2］Johanson G.Analysis of ethylene glycol ether metabolites in urine by extractive alkylation and electron－capture gas chromatography［J］.Arch Toxicol，1989，63(2):107 －111.