实验考察柴胡与黄芩配伍前后柴胡皂苷a、d的溶出性差异

侯绪浩，刘逢芹，杨晓静，刘田云

(1.山东中医药大学，山东 济南250355;2.山东大学附属千佛山医院，山东济南250014)

中药柴胡与黄芩配伍应用在中医临床极为常用，是中药方剂中的传统药对［1］，研究表明两药配伍后可明显提高其相关药理药效作用［2，3］。为探讨该药对配伍前后药效物质基础的异同和配伍的合理性，笔者对药对配伍前后提取出的主要药效成分进行了实验比较，结果显示药对配伍对主要药效成分黄芩苷影响不大［4］，本文又采用HPLC法实验考察了药对配伍前后柴胡主要药效成分柴胡皂苷a和d的含量变化，以期从实验药学角度阐明中药配伍应用的机理，促进临床的组方配伍和合理用药。

1 仪器与试药

1.1 仪器 HPLC色谱仪(Waters公司产品)，Waters 600色谱泵，Waters 2996紫外检测器，Waters717自动进样器，Empower工作站;BCP225D型十万分之一分析天平(赛多利斯仪器有限公司);KQ－100DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司生产)，0.45 μm有机微孔滤膜(上海市新亚净化器件厂生产)。

1.2 试药 药材柴胡(批号 20060501)、黄芩(批号20070601)购于山东天一中药饮片有限公司，经山东省中医药研究院生药专家鉴定为唇形科多年生植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根和伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.(北柴胡)的干燥根;柴胡皂苷a、d均购于中国药品生物制品检定所，批号分别为110777－200406、110778－200505;甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司产品，批号20070110，色谱纯)，乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司产品，批号20070606，色谱纯)，正丁醇(天津市化学试剂一厂产品，批号20061218，分析纯)，水(杭州娃哈哈集团有限公司产品，批号20080102)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);以乙腈为流动相A，水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱;流速:1 mL·min－1;检测波长为210 nm;柱温:室温;进样量:10 μL;理论塔板数以柴胡皂苷a峰计算不低于3 000。按以上条件进行测定，可使供试品中柴胡皂苷a、d色谱峰得以分离，且峰形良好，见图1。

表1 梯度洗脱顺序

图1 柴胡－黄芩药对的HPLP图谱

2.2 供试溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 取柴胡皂苷a对照品约15 mg、柴胡皂苷d对照品约15 mg，精密称定，置同一容量瓶中，加甲醇溶解至50 mL，制成每1 mL约含柴胡皂苷a 300 μg，柴胡皂苷d 300 μg的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液［5］精密称取柴胡药材粗粉5 g、1∶1配比的柴胡黄芩药对粗粉10 g，各加70%乙醇500 mL，浸泡0.5 h，回流1.5 h，过滤，提取液蒸去乙醇，加水适量，分别用乙醚萃取2次(40，40 mL)，弃取乙醚液，提取液水浴蒸至无乙醚味，冷至室温再加水饱和的正丁醇液萃取3次(20，20，20 mL)，合并正丁醇溶液，用1%氢氧化钠溶液洗涤2次(20，20 mL)，再用正丁醇饱和的水洗至中性，蒸去正丁醇，残渣加甲醇25 mL使溶解，作为供试品溶液。

2.3 柴胡皂苷a、d测定方法学考察

2.3.1 标准曲线绘制 取柴胡皂苷a、d混合对照品溶液，分别进样 5、10、15、20、25 μL，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标(S)，进样量(μg)为横坐标(A)，绘制标准曲线，计算得回归方程，结果见表2。

表2 柴胡皂苷a、d的线性回归方程

2.3.2 精密度试验 取柴胡皂苷a、d混合对照品溶液重复进样5次，每次2 μL，检测柴胡皂苷a、柴胡皂苷d峰面积积分值，结果柴胡皂苷a峰面积值的RSD为0.85%、柴胡皂苷d峰面积值的RSD为1.04%，说明仪器的精密度良好。

2.3.3 重现性试验 取黄芩－柴胡(5 g－5 g)样品5份，按照2.2.2项下的方法制成供试样品溶液，分别测定柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量，样品中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d含量的RSD分别为2.78%、3.14%，表明重现性较好。

2.3.4 稳定性考察 取柴胡皂苷a、d的混合对照品溶液分别于0、2、6、24 h进样，测定柴胡皂苷a及柴胡皂苷d的峰面积，计算其峰面积的RSD分别为1.42%、1.29%，表明柴胡皂苷a、d在24 h内稳定。

2.3.5 方法回收率 精密称取已知含量的柴胡药材粗粉约1.0 g，置100 mL容量瓶中，加70%乙醇约80 mL，密闭浸泡0.5 h，精密量取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d对照品混合溶液8 mL，加70%乙醇至刻度，按“2.2.2”项下操作，制备成加样回收率供试样品溶液，依照“2.1”项下方法和条件进行测定，结果见表3。

表3 柴胡皂苷a、d加样回收率(n=5)

2.3.6 柴胡皂苷a、d含量测定 取2.2.2项下的各供试品溶液按照“2.2.1”项下色谱条件进样，分别测定柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量，结果见表4。

表4 黄芩－柴胡配伍药对的柴胡皂苷a、d 含量(%)(n=3)

3 讨论

3.1 从实验结果中可以看出，黄芩－柴胡“药对”配伍后柴胡皂苷a，d的溶出大大提高，柴胡皂苷a的提出量几乎比柴胡单用的溶出量多一倍，柴胡皂苷d的提出也比配伍前提高了45%，实验充分说明了药对混合提取有利于柴胡皂苷部位的溶出。围绕药对配伍展开的研究是探索中药复方配伍规律研究的基础和切入点，该实验结果从化学成分研究的角度为已被长期临床实践所证实的古人配伍用药理论提供了科学依据。

3.2 实验予试中曾参照中药传统提取方法采用水提取，但发现水作溶媒对柴胡皂苷的提取效率不佳，且干扰较大，尤其是柴胡皂苷d，水几乎不能将其提出，认为提取溶媒采用乙醇比较合理，更能较为完全地将有效组分提出，参考文献［5］并经多次试验摸索，最后确定采用70%的乙醇溶液提取效果较好，结果显示与中药混煎增溶理论相一致;另外应针对柴胡黄芩之间的配伍比例展开相应探讨，以找出最佳药对配比，为临床合理用药提供依据，改革提取工艺，提高中药材的利用率。

［1］景浩.小柴胡汤临床应用新进展［J］.辽宁中医学院学报，2000，2(1):67 －69.

［2］王宪龄，张丽萍，李连珍，等.柴胡黄芩配伍不同提取部位对扑热息痛所致小鼠急性肝损伤的保护作用［J］.中药药理与临床，2005，21(3):10 －11.

［3］王宪龄，申平，李连珍.柴胡黄芩及其不同剂量比例配伍对小鼠小肠推进功能的影响［J］.中药药理与临床，2004，20(4):1 －2.

［4］刘逢芹，刘田云，余晓东，等.RP－HPLC考察黄芩、柴胡配伍对黄芩苷成分的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2009，15(7):3 －5.

［5］霍务贞，孙严彤，朱盛山.柴胡有效成分提取条件的研究［J］.广东药学，2005，15(4):6 －7.

［6］林东昊，茅仁刚，王智华，等.HPLC测定不同产地北柴胡中柴胡皂苷 a、c、d［J］.中成药，2002，24(5):60 －62.