高效液相色谱-Ru（bipy）32+-Ce（SO4）2化学发光体系检测啤酒中的亚硫酸钠

龙星宇，陈福南

（西南大学化学与化工学院，重庆 400715)

高效液相色谱-Ru（bipy）32+-Ce（SO4）2化学发光体系检测啤酒中的亚硫酸钠

龙星宇，陈福南*

（西南大学化学与化工学院，重庆 400715)

在酸性条件下，Ce（SO4）2氧化Ru（bipy）32+时，在Na2SO3存在下，对该化学发光具有很强的增敏作用，据此建立通过HPLC分离、用化学发光检测器测定亚硫酸钠的方法。在优化的实验条件下，测定亚硫酸钠的线性范围为2.0×10-6～ 5.0×10-4g/mL，方法的检出限为6.0×10-7g/mL，定量下限为2.0×10-6g/mL，线性回归方程：ΔI=3.578c+19.721（c：g/mL；r2=0.9984），对5.0×10-5g/mL亚硫酸钠进行了11次平行测定，其相对标准偏差为3.7%。该法已成功的运用于实际啤酒样中亚硫酸钠的含量。

高效液相色谱，化学发光，钌联吡啶，硫酸铈，亚硫酸钠

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

无水亚硫酸钠 浙江省永嘉县化工试剂厂，分析纯，批号：国药准字100408；乙腈 色谱纯，Fisher Scientific公司；钌（Ⅱ）联吡啶 Newburyport，USA；硫酸铈 国药集团化学试剂有限公司，批号：F20080303；水 超纯水。

KromasilTMC18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）Dikma Technologies公司；高效液相色谱-化学发光分析检测系统如图1所示；D-7000HPLC高效液相色谱仪，L-7100泵 Hitachi，Japan；微弱发光分析检测仪MCFL-A，西安瑞迈；AGE微量进样器（50μL） 宁波市镇海玻璃仪器厂；CQ-2200型超声波清洗器 上海沪超超声波仪器有限公司；UNIQUE-R10多功能超纯水机 锐思捷；HL-2恒流泵 上海清浦沪西仪器厂。整个检测分析过程中实验数据的采集和处理，均由Windows XP系统下D-7000 HSM软件（Hitachi.Ltd. 1994-2001 Version 4.0）和BPLC软件共同完成。

图1 高效液相色谱-化学发光法检测系统示意图Fig.1 HPLC-CL detection system

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制 0.1mol/L硫酸铈储备液：准备称取4.0400g硫酸铈，用0.05mol/L的H2SO4溶液溶解并定容至100mL的容量瓶中；实验条件中所用浓度，皆是用0.5mol/L硝酸稀释至所需浓度。1.0×10-3g/mL钌联吡啶储备溶液：精确称量0.1000g的钌（Ⅱ）联吡啶用水定容至100mL的容量瓶中。1mg/mL亚硫酸钠储备液：称量亚硫酸钠约0.1g左右，溶解于流动相中，超声溶解5min，定容至100mL的容量瓶中，并用碘量法标定后使用。并于当天临用时现配。以上试剂使用时逐级稀释。

1.2.2 实验条件 KromasilTMC18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）。流动相：乙腈-水（40∶60，v/v），在使用前经0.22μm滤膜抽滤超声脱气（15min）处理；流速：0.8mL/min；进样量：20μL；柱温：室温；压强：大气压。

1.2.3 操作方法 按图1将装置安装好进行操作，仪器预热20min，设置好仪器参数，初始化仪器软件。在使用高效液相色谱前，分别用超纯蒸馏水及流动相充分冲洗柱子，待基线稳定后，取用碘量法标定好的亚硫酸钠标准溶液或啤酒样品溶液20μL进样，记录仪记录化学反应的发光信号，以相对峰高定量（三次求平均）。

1.2.4 样品处理 对市售四种不同品牌的啤酒样液先经0.22μm滤膜过滤，滤液密封保存在4℃冰箱中待用，保存时间不超过2d。

2 结果与讨论

2.1 化学发光条件

2.1.1 介质酸的选择 分别考察了H3PO4、HCl、HNO3、H2SO4四种酸介质，对此化学发光体系的影响。提供酸性环境，使氧化剂Ce（Ⅳ）处于活性氧化剂状态。实验发现HNO3作为介质时，可使化学发光强度达到最大，这可能是由于HNO3本身具有较强的氧化性[12]。所以，本实验选择HNO3为酸性介质。

2.1.2 介质酸HNO3的浓度 在酸性环境当中，氧化剂的氧化能力显著增强。我们考察了HNO3在0.2～ 2.0mol/L范围内，该发光体系化学发光的强度。在此浓度范围内，随着酸的浓度增加，化学发光强度明显减小，之后变化不大趋于平稳（如图2所示），这可能是由于溶解氧化剂硫酸铈时所用的0.5mol/L硫酸，足以保证氧化剂以足够多的活性氧化态形式存在。所以，本实验选择HNO3的最佳浓度为0.5mol/L。

图2 硝酸浓度的影响Fig.2 Effect of HNO3concentration

2.1.3 Ru（bipy）32+的浓度 Ru（bipy）32+作为发光试剂，其浓度对化学发光强度起着非常重要的作用。在选定的介质硝酸及其浓度的前提下，固定其它条件不变，研究Ru（bipy）32+的浓度在2.0×10-5～5.0×10-4g/mL范围内化学发光体系的相对化学发光强度。实验表明，随着发光试剂浓度的不断增加，ΔI值不断增大，但当其浓度超过8.0×10-5g/mL时，尽管发光信号增大，但背景值也随之升高，即ΔI值减少。综合考虑发光强度与背景值各自因素的影响，最终选取8.0×10-5g/mL作为Ru（bipy）32+的最佳浓度（见图3）。

图3 钌联吡啶浓度的影响Fig.3 Effect of Ru（bipy）32+concentration

2.1.4 Ce（SO4）2的浓度 Ce（SO4）2作为氧化剂，在该化学发光体系中的作用不可忽视。固定其它条件不变，分析了Ce（SO4）2在4.0×10-4～1.5×10-3mol/L浓度范围内的发光信号。如图4中，当Ce（Ⅳ）浓度过小时，体系不能提供足量的氧化剂，不能使发光强度达到最大，只要满足体系当中存在足量的氧化剂即可。则本实验选择Ce（SO4）2的最佳浓度为8.0×10-4mol/L。

图4 硫酸铈浓度的影响Fig.4 Effect of Ce（SO4）2concentration

2.1.5 恒流泵流速 在流动注射化学发光分析中，反应载体的流速是影响化学发光强度的一个重要因素。流速过慢会导致发光在流通池之前；同样若流速过快会导致发光在流通池之后，不适宜的流速都可能导致在流通池中检测不到最大发光信号。本文在固定流动相流速（1mL/min）及其它条件不变的情况下，考察了不同流速对化学发光反应的影响。结果表明，随着流速的增大，发光信号增大，增大到一定程度后，发光信号逐渐降低，兼顾灵敏度和分离度的要求，反应试剂流速选择为1.45mL/min。

2.2 色谱分离条件

2.2.1 流动相 一般常用作流动相中的有机相为甲醇和乙腈。考察了甲醇-水、乙腈-水相同比例下，在该化学发光体系中二者之间的相对发光强度。结果发现，两种不同的流动相均可对目标物质进行分离，并都对发光体系有抑制，尽管甲醇-水对化学发光抑制要小，但其基线不稳，易发生漂移；乙腈-水对化学发光的抑制较大，但其基线较平，背景值较小，峰形对称。因此我们选择乙腈-水作为色谱分离的流动相。进一步考虑乙腈的体积分数对化学发光信号的影响。实验表明，乙腈的体积分数为30%～70%之间的流动相，都可以使亚硫酸盐与其它成分得到很好地分离，保留时间相差不是很大。当其为40%时可检测到化学发光强度最大，而乙腈体积分数大于40%时，化学发光强度急剧下降。所以，我们选用乙腈∶水= 40∶60（v/v）的流动相。

2.2.2 高压泵流速 我们探究了0.5～1.3mL/min范围内的高压泵流速。实验发现高压泵流速快，保留时间短，但是分离不彻底。反之，若高压泵流速慢，流动相与发光体系易形成高的背景值，而且峰形较宽，峰展宽较大。综合考虑分离效果与信噪比，实验选择高压泵最佳流速为0.8mL/min。

2.3 校准曲线、相对标准偏差和检出限

在上述选定的最佳实验条件下，亚硫酸钠的浓度在2.0×10-6～5.0×10-4g/mL范围内与相对发光强度呈良好的线性关系，其线性回归方程为ΔI=3.578c+19.721（c：g/mL）；r2=0.9984；根据IUPAC建议，按3倍空白信号的标准偏差计算，方法的检出限为6.0×10-7g/mL。对5.0×10-5g/mL浓度的亚硫酸钠平行测定11次，其相对标准偏差为3.7%。亚硫酸钠的保留时间为2.15min。

2.4 样品分析

一份准确量取1mL滤液（1.2.4方法中已处理好的滤液）于10mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，根据图1所示，进行样品测定；另一份准确量取1mL滤液（1.2.4方法中已处理好的滤液）于小烧杯中，并加入1mL 1mol/L HNO3，置于超声清洗仪中超声处理5min驱赶二氧化硫气体后，再转入10mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，按1.2.3进行测定，两份样品溶液化学发光强度的差值即为亚硫酸根所产生的化学发光强度。图5为所加入的HNO3对啤酒样品处理的色谱图及HNO3空白色谱图。实验表明，酸化处理前后，亚硫酸盐的特征保留时间处不受干扰可以用于定量分析，整个分析时间不超过400s。图6为实测亚硫酸钠和实际啤酒样品的色谱分离图。HPLCCL测定市售四种不同品牌的啤酒中所含亚硫酸钠的结果见表1。

图5 HNO3色谱图Fig.5 HNO3Chromatogram

表1 HPLC-CL方法测定四种市售不同品牌啤酒中亚硫酸钠的结果Table 1 Results of HPLC-CL method determination sodium sulfite in four kinds of beer sold in the city

图6 色谱图Fig.6 Chromatogram

3 结论

本文采用高效液相色谱-化学发光联用的方法检测啤酒样中的亚硫酸钠，线性范围为2.0×10-6～5.0× 10-4g/mL，最低检测限为6.0×10-7g/mL，对5.0×10-5g/mL浓度的亚硫酸钠平行测定11次，其相对标准偏差为3.7%，精密度较高；回收率在95.1%～103.9%之间，结果也表明，这四种啤酒中亚硫酸钠的含量均没有超标。该方法应用于食品中添加剂的测定，对样品不需要进行酒精的蒸馏，整个分析时间不超过400s，简便快速、结果准确可靠，并成功应用于啤酒中亚硫酸钠的检测。

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Determination of sodium sulfite in beer samples by high performance
liquid chromatography with Ru（bipy）32+-Ce（SO4）2chemiluminescence detection

LONG Xing-yu，CHEN Fu-nan*
（School of Chemistry and Chemical Engineering of Southwest University，Chongqing 400715，China）

The CL radiation was emitted in the reaction of cerium sulfate oxidation reagent with tris （2，2-bipyridyl）ruthenium（Ⅱ）in the presence of acid.The existence of sodium sulfite made the reaction more sensitive

and strong.The optimal conditions for the CL detection were studied and a new method for determining sodium sulfite was described by HPLC-CL.The linear range was 2.0×10-6～5.0×10-4g/mL with the detection limit of 6.0×10-7g/mL，linear regression equation：△I=3.578c+19.721（c：g/mL；r2=0.9984），and the relative standard detection was 3.7%for 5.0×10-5g/mL.This method has obtained satisfactory results in the analysis of sodium sulfite in beer samples.

high-performance liquid chromatography；chemiluminescence；Ru（bipy）32+；Ce（SO4）2；sodium sulfite

TS207.3

A

1002-0306（2012）05-0320-04

亚硫酸钠是一种重要的食品添加剂，在食品的各种处理过程和储存环境中，能非常有效地阻止酶和非酶类物质发生酶促反应。同样，它也可抑制食品中微生物所引起的酸化和酸败[1-2]。但亚硫酸盐能诱发部分人出现严重的哮喘[3-4]，而且在食品中添加过量的亚硫酸盐也会使食品丧失原有的香味[5]，此外，亚硫酸盐在体内被氧化生成硫酸盐，易刺激消化器官[6]。因此，我国《食品添加剂使用卫生标准》（GB2760-2007）对各类食品中亚硫酸盐的允许限量有明确规定。我国标准GB/T5009.34规定用盐酸副玫瑰苯胺比色法来测定[7]，但由于在操作过程中使用剧毒溶液，对环境造成污染，对于复杂样品的检测结果不好，干扰因

2011－03－28 *通讯联系人

龙星宇（1982-），男，硕士研究生，主要从事高效液相色谱和化学发光在食品方面的研究。

西南大学博士基金项目（2120040511）。素多，且检测时间长。化学发光分析法具有灵敏度高、线性范围宽、仪器设备简单等优点，加上高效液相色谱高效分离的特点，使HPLC-CL方法的联用得以广泛运用[8-11]，成为一种有效的痕量及超痕量分析技术。三（2，2-联吡啶）钌（Ⅱ）Ru（bipy）32+是一个灵敏的化学发光试剂，在酸性条件下，以Ce（SO4）2为氧化剂，Na2SO3可以成比例增强Ru（bipy）32+的化学发光强度。据此，建立了以此化学发光体系测定亚硫酸钠的分析方法，并以HPLC色谱分离，测定实际啤酒样中亚硫酸钠的含量。