微波辅助技术在大分子蛋白质研究中的应用

马申嫣，范大明，赵建新，*，庞 珂，陈 卫，张 灏

（1.江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2.无锡华顺民生食品有限公司，江苏无锡214218）

微波辅助技术在大分子蛋白质研究中的应用

马申嫣1，范大明1，赵建新1，*，庞 珂2，陈 卫1，张 灏1

（1.江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2.无锡华顺民生食品有限公司，江苏无锡214218）

微波技术作为一种高效的物理方法，具有广泛的应用价值，近年来已成为国内外研究的热点。介绍了微波对蛋白质的作用机制，并围绕微波在蛋白质研究过程中的生物化学分析、多肽制备、有机合成和酶催化反应中的辅助应用进行了综述，为该领域的进一步研究及应用提供理论基础。

微波，蛋白质，分析，制备

蛋白质是生物体细胞的重要组成成分，在细胞的结构和功能中起着重要作用；同时作为食品中重要的组成成分，具有不可取代的营养特性，提供人体必需的氨基酸，显著影响食品品质[1]。蛋白质如此多样化的功能与其化学组成密切相关，作为一种大分子物质，由不同氨基酸以肽键相连而成。大量研究发现[2-3]，一些化学或物理方法可以将氨基酸的肽键断开或连接，从而实现相应的分析与制备。目前，用于蛋白质裂解的主要方法为化学法和酶法[4]，化学法简单廉价，但反应条件剧烈，难以控制裂解程度，且容易产生有毒物质；酶法反应条件温和，具有高效性、专一性，但是酶解效率相对较低，常规水浴酶解需要几个小时，耗时费力。微波辅助蛋白质裂解技术作为一种物理方法，可以代替常规传导加热，大幅度提高蛋白质的裂解效率，便于程序操作。同样，常规加热方法在蛋白质的合成中也存在效率低、反应时间长等缺点。因此，微波具有广泛应用于蛋白质裂解和合成过程的优势。然而，由于微波与生物体的相互作用是一个极其复杂的过程，微波对蛋白质作用的机理还在不断完善。鉴于上述背景，本文综述了近年微波辅助大分子蛋白质的最新研究，希望以此深化微波与蛋白质相互作用的探讨，推动微波在蛋白质裂解与合成过程的广泛应用。

1 微波对蛋白质作用机理

目前，关于微波对蛋白质作用的机理研究仍处于不断完善阶段。许多学者认为在此过程中只存在热效应[5-6]，然而在作用过程中所出现的一些异常现象是热效应所无法解释的[7-8]，因此，又有学者推测微波还存在非热效应。现阶段，非热效应理论尚处于模型和争论阶段。近年来，已有不少学者证实微波具有非热效应[9-10]。

近年来，微波辅助蛋白质的研究主要利用其热效应。在蛋白质溶液体系中，水和蛋白质都属于电介质，具有吸收微波的良好特性。这些分子以极性共价键结合，正、负电荷中心不重合而形成偶极，整个分子呈现电荷的极性。在自由状态下，它们杂乱无章地排列，正负电荷相互抵消，总体不显电性。当处于电磁场中时，这些相当于一个个小磁针的极性分子就显现呈方向排列的趋势，当电场方向改变时就会引起分子极的转动。电场频率过大或过小都不会引起整个分子动能的剧烈变化；但频率处于两种极端之间时，分子偶极既有重排的时间，又不能准确应激交流电场的变化，导致电场方向与偶极方向之间形成相位差，该相位差使得能量通过分子间的摩擦和碰撞被消耗，产生介电加热，这就是微波热效应的原理[11]。极性分子高速“摩擦”产生的热量不同于传统的热传递加热方式，后者基于传导、对流、辐射的方式将热量由表及里传入物料的内部，加热速度慢，加热不均匀；而前者则采用内外同时加热的方式，加热迅速且均匀。

关于微波对蛋白质作用的机理，热效应理论认为：水、蛋白质等极性分子受到交变电场的作用而剧烈振荡，相互“摩擦”产生热量，从而导致温度升高，使蛋白质分子结构发生改变，最终实现蛋白质的裂解与合成。

微波非热效应是指除热效应以外的其他效应，如电效应、磁效应及化学效应等，即在没有明显温度变化的情况下，蛋白质所发生的结构和功能上的变化。大量实验表明微波能影响蛋白质的折叠和展开，究其作用机理，不少研究人员认为微波非热效应在此过程中具有不可替代的作用。蛋白质的结构决定功能，所以微波能通过改变蛋白质构象影响酶的催化活性，而且，微波与传统加热方法相比对酶活的影响存在显著差异，很多文献因此认为这并不仅仅是由热效应引起的，微波加热还具有非热效应。如Bohr H等[12]以β-乳球蛋白为研究对象，研究微波对球状蛋白构象的影响，发现在可逆变性阶段，随着温度升高，蛋白质展开的过程中，微波的加入促进了蛋白质的展开；随着温度的降低，蛋白质折叠的过程中，微波的加入对蛋白质的折叠过程同样起到了促进作用。由此，他们认为微波促使蛋白质折叠变性不仅仅是熵驱动的，也是扭转力和弯曲力竞争的结果，也就是说微波对蛋白质的影响存在非热效应。更有研究发现，微波的非热效应会使牛血清白蛋白形成类淀粉质结构[13]。Cara等[14]从酸热芽孢杆菌（Bacillus acidoca ldarius）提取了嗜热β-乳糖酶，并比较低能微波处理与传统水浴加热对不同浓度酶活的影响，证实在70℃条件下微波处理1h可以使浓度为10～50μg/mL的嗜热β-乳糖酶发生不可回复的失活，而70℃水浴加热对酶活没有影响；当酶浓度为50～100μg/mL时，微波对酶活没有影响。所以，微波对酶活性的影响并不仅仅是热效应，即使在没有吸收大量热的情况下也能改变蛋白质的构象。

2 微波辅助蛋白质研究

2.1 微波辅助蛋白质生化分析

蛋白质是细胞中含量最丰富的生物高分子有机物，在生化分析中，蛋白质的分离和结构解析占据很重要的位置，运用质谱进行蛋白质一级结构的鉴定，最重要的一步就是对蛋白质进行水解。微波技术作为一种快速高效的加热技术，可以用于此类处理过程，大幅缩短蛋白质完全水解时间。

Lin等[2]对微波辅助胰蛋白酶催化反应进行了系统研究，在不同的有机溶剂中水解不同的蛋白质（肌球素、细胞色素和溶解酵素等），甲醇浓度过高会使酶失活，而丙酮和氯仿不会影响酶的活性。但是，无论在哪种溶剂中，微波辅助水解的效率都高于常规方法，这是因为传导加热所需时间长、升温慢都会导致酶失活，而微波加热可以在短时间内达到很高的温度，在酶彻底失活之前完成水解。Juan[15]等用微波辅助内切蛋白酶、胰蛋白酶将蛋白质水解，经处理的五种蛋白质水解时间从常温反应的16h减少到了5min，然后进行二维电泳和质谱分析，结果表明微波方法优于常规方法。同样，在微波辅助酸水解过程中也得到了相似结论。Zhong等[16]用6mol/L HCl处理细胞色素C等蛋白质，在微波辐射下水解30～90s，再用质谱分析多肽链结构，得到非常专一的多肽残基峰位图，没有内部干扰峰，表明微波辅助酸水解优于常规方法。Lin[17]等在经典酸水解反应的基础上，使用微波辅助快速水解蛋白质技术，稀甲酸可以将蛋白质水解成多肽，而且样品不需要纯化就可以进行质谱检测，有效缩短实验时间，简化实验过程。

Marconi E[18]、崔蕊静[19]、施文正[20]等也得到了类似的实验结果，证实了微波水解的高效性，但没有进一步研究微波水解与常规水解方法得到的氨基酸序列是否一致。Marconi E等[21]以牛血清蛋白为模型蛋白，将微波水解和传统方法水解得到的氨基酸序列与理论值进行比较，得出两种水解方法的效果一致，作者还将这两种水解方法应用于乳酪和硬质小麦两种食品模型上，并对其进行相关性研究，结果同样表明这两种方法得到的水解产物种类、含量显著相关。但是，Wu等[22]研究了弱酸环境中微波裂解肽链的情况，得出微波裂解肽键相对传统方法具有快速、有选择性的特点，且微波裂解的位置一般在天冬氨酸残基的羧基和氨基末端。

2.2 微波辅助制备蛋白质多肽

近年来，多肽的生理功能受到越来越多的重视。作为一种蛋白质水解产物，多肽结构简单、分子量小、易被机体吸收利用，以及功能性的高效表达，成为人体需要而且依靠外源摄入的活性物质[23]。但是，功能性多肽多以聚合物（蛋白质）的形式存在，分子量大、结构复杂，摄入人体后不易被靶向分解、消化吸收，从而影响了其生理功能和营养价值的发挥。

目前，国内外制备多肽的方法主要有：蛋白酶水解法、化学合成法、基因重组法和分离提取法等，其中酶法条件温和，对蛋白质营养价值破坏小，使得酶法成为生产功能性多肽的主要途径[4]。但是，常规的酶解反应需要在液相体系中进行，耗时费力。近年来，许多科研人员尝试使用多种物理辅助手段缩短酶解时间，提高酶解效率。微波作为一种常用的物理辅助手段，广泛应用于多肽的制备。李菊芳等[24]以脱脂菜籽粕为原料，研究了碱性蛋白酶和风味蛋白酶分步酶解菜籽粕制备菜籽多肽，得出利用微波辅助技术可以大幅提高酶解效率，高通量制备相对分子质量在1000u左右的短肽。李利军等[25]以家蚕废丝为原料，建立并优化丝素肽的微波辅助酸水解工艺，得出微波辅助产品回收率比磷酸水解方法提高约15%，且节省4～5h的水解时间。由于微波辅助制备多肽具有快速、高效和无污染的特性，刘静[26]、王岩[27]等也将其分别应用于制备小分子大豆肽和混合蛋白肽，取得了显著的效果。

除此之外，在化工领域，国内外研究人员为了提高一些困难的多肽合成反应效率，也尝试将微波应用于化工领域，辅助合成生物活性寡肽、多肽和相应聚合物[28]。Tantry等[29]使用酰氯和耦合剂辅助合成多肽，比较了传统化学合成法和微波辅助合成法的优劣，结果表明，720W条件下，微波辅助合成多肽仅需30～45s，合成率高于90%；传统热处理每一步反应均需要15～30min，较微波辅助合成法有明显的劣势。在无溶剂及催化剂的条件下，陶虎春等[30]以氨水为原料微波辅助湿法合成聚天冬酰胺，得出微波辅助合成产物的碳酸钙阻垢性能优良，与传统加热方法制备的产物性能相近，且微波工艺具有反应速度快、产率高、节能和污染少等优点。同样，Marek等[31]研究了微波辅助D，L-天冬氨酸缩聚反应，也得到了相似的结果。

总之，微波辅助化学合成多肽反应，可以减少甚至杜绝化学催化剂的添加，实现提高反应效率的同时，减少产品中的杂质[32]。

2.3 微波辅助蛋白质有机合成

微波作为一种新型的加热方式已被广泛应用于有机合成等领域。在过去30年，微波辅助合成的方法几乎被应用到所有类型的有机反应中。与传统加热方式相比，微波可提高反应得率或大幅缩短时间[33]，有时还表现出和常规加热不同的选择性[34]。Orliac等[3]在无溶剂的条件下，以酯化葵花蛋白为目标物，对经典酯化方法和微波酯化方法进行了比较，得出经典酯化方法用时4h，有84%的葵花蛋白发生了酯化，而微波酯化只需18min就有89%发生了酯化，并发现微波酯化得到的酯化蛋白水解程度小。尽管有关微波辅助蛋白质有机合成的研究报道已屡见不鲜，但是相比于常规加热，微波加速或改变蛋白质有机合成的反应机理并不明晰。目前认为微波存在3种可能的效应：微波热效应、特殊的微波热效应和微波非热效应。关于微波在蛋白质合成中的作用，学术界普遍存在两种观点：一是微波非热效应，Guan等[35]使用微波改善大豆分离蛋白-糖接枝反应，结果表明微波加速了反应进程，作者认为这是由微波非热效应引起的，微波使大豆分离蛋白分子中的非共价键及二硫键断开，亚基解聚，分子充分伸展，反应活化能也相应降低，从而提高了大豆分离蛋白-糖接枝反应的速率；二是微波热效应，认为微波辅助蛋白质有机合成产生不同效果的原因是温度控制不准造成的。Shazman等[36]使用传统加热和微波辅助加热方法，分别使三种葡萄糖-甘氨酸溶液发生美拉德反应，以褐变程度为测量指标，用在线分光光度计监测，结果发现两种加热方式下的产物褐变程度无显著差异。Meissner和 Erbersdobler[37]以牛奶为研究对象，同样使用传统加热法和微波辅助法使之形成美拉德反应产物，也得到了类似结论，因此认为微波辅助蛋白质化学合成不存在非热效应。

2.4 微波辅助酶催化反应

1990年以来，微波被应用于生物催化反应尤其是非水相酶催化反应中。过度的微波处理会损伤酶的催化活性甚至使酶蛋白消解，但对大多数具体的酶促反应而言，适当的微波处理与常规加热相比具有明显优势[38]，于是微波辅助酶催化技术开始被广泛应用。

蔡汉成等[39]以戊醇同分异构体与n-辛醇为反应底物，比较了常规加热、在线微波处理和微波预处理酶三种模式下的非水相酶催化酯化反应，发现微波辅助酶催化不仅加快了反应速率2.5～4.5倍，同时也提高了反应物得率。同时研究了微波辅助脂肪酶催化n-辛酸与n-丁醇酯化反应动力学，发现微波条件下，反应动力学特征受到微波微弱的干扰，但并没有从本质上改变酶催化反应的Ping-Pong Bi-Bi机制，只是在某一范围内使反应偏离该机制。

Yadav等[40]研究了微波加热和常规加热脂肪酶Novozym 435催化乙酰乙酸甲酯和正丁醇的酯交换反应动力学。分别固定一种底物和加酶量，考察两种加热模式下另一底物浓度变化对反应初速度的影响，发现两种加热模式下反应均遵循Ping-Pong Bi-Bi机制，即微波辐射并未改变酶催化反应的动力学机制。在他们近期的另一研究[41]中，采用微波辅助酶催化合成二甘醇月桂酸酯，也得出了类似的结论，而且他们还发现了反应在低温微波加热下能顺利进行，合成速率比传统方法快33%，当反应温度超过60℃时，由于酶被破坏，反应速度急剧下降。

微波辅助酶催化在化工合成领域已显示出了巨大的发展前景，但是有关它的研究仍处于实验积累阶段，在机理等研究方面还不够全面和深入，而且目前市售的大多数微波反应器尚不能满足微波辅助酶催化反应精细的控温要求，或相对于普通化学反应而言较低的反应温度要求，因此，还需要进一步的深入研究并且完善研究手段和方法。

3 结论

目前，微波由于其独特的加热性质而受到越来越多的重视，在辅助蛋白质研究过程中取得了一些成果，但相关机理研究尚不完善，需进一步建立相应模型，对微波影响蛋白质结构因素动力学进行深入研究，从而明确微波在辅助蛋白质研究过程中的作用机制，完善知识体系，为进一步的工业化推广奠定基础。

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Applications of microwave assisted technique in protein research

MA Shen-yan1，FAN Da-ming1，ZHAO Jian-xin1，*，PANG Ke2，CHEN Wei1，ZHANG Hao1
（1.National Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Wuxi Huashun Minsheng Food Co.Ltd.，Wuxi 214218，China）

As an efficient physical method，microwave has widely applied in many areas.Nowadays the microwave technique has become a focus both at home and abroad.The mechanisms of microwave interact on the protein wereaddressed.Furthermore，microwaveassistedproteinresearch，suchasproteomicanalysis，orientedhydrolysis，organic synthesis and enzyme coupling catalysis were discussed，so as to provide theoretical basis for the further research of this area.

microwave；protein；analysis；preparation

TS201.2+1

A

1002-0306（2012）05-0384-05

2011－04－20 *通讯联系人

马申嫣（1987-），女，硕士研究生，研究方向：食品生物技术。

国家科技支撑计划（2008BAD91B03）；国家科技部农业科技成果转化资金项目（2008GB2B200083）。