不同产地肿节风药材多酚类成分及抗氧化活性比较

南华大学附属第一医院（4200）黄明菊 李卓

中南大学（410013）周应军2

肿节风为金粟兰科（Chloranthaceae）草珊瑚属植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai.的干燥全株，分布于我国长江流域以南各省。肿节风具有清热凉血、活血消斑、祛风通络等功效，临床上主要用于治疗恶性肿瘤、感染性疾病、口腔疾病、跌打损伤等症[1][2][3][4]。我们的前期研究已从肿节风药材的水提取液中分离并鉴定了23个单体成分，同时对肿节风抗氧化活性进行了初步研究，试验结果表明，肿节风多酚类部位具有很强的抗氧化活性，而且由此部位分离得到的多种化学成分也具有很强的抗氧化活性[5][6][7][8][9]。

为进一步分析研究肿节风的化学成分组成及抗氧化活性，本研究采用高效液相色谱法（HPLC）对肿节风多酚类部位进行了分析，通过与对照化合物比较（保留时间和紫外吸收图谱），标定了HPLC图谱上的14个主要的色谱峰，分析了7个不同省份肿节风药材的HPLC色谱图，试验结果表明，各省份药材的成分组成基本相同，成份组成主要有3种类型：咖啡酸衍生物、黄酮类和香豆素类，但图谱上各主要色谱峰的峰面积差异较大。不同产地肿节风药材均有抗氧化活性，但不同产地活性大小差异较大。HPLC图谱总峰面积与抗氧化活性大小基本一致。现将我们的研究分析报告如下，以便为相关技术人员对肿节风药材的质量控制与开发利用提供一个参考依据。

1 仪器、试剂与药材

1.1 仪器 Agilent 1100型高效液相色谱仪，配置四元梯度泵，在线脱气机、自动进样器、DAD检测器、Chemstation色谱工作站；BP210S型电子天平（德国Sartorius公司），Elx-800型酶标仪（美国Bio-Tek公司）。

1.2 试剂与药材 乙腈为色谱纯（TEDIA company），水为市售纯净水，丙酮（湖南师大化学试剂厂）、磷酸（汕头市光华化学厂）、碳酸氢钠（天津市巴斯夫化工厂）均为分析纯，聚酰胺（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）。DPPH•（二苯代苦味酰基自由基）购于SIGMA公司；95%乙醇（分析纯，购自天津博迪试剂公司）。对照化合物（经HPLC检测纯度均大于90%），均为从肿节风中分离所得，并通过化学与波谱手段鉴定其结构。肿节风药材7批，均从各产地购买。

2 方法

2.1 肿节风多酚类部位储备液的制备 精密称取肿节风药材10.0g，加水250mL煎煮1小时后，加水补足失重，过滤，取续滤液200mL，并将其减压浓缩至小体积，加水补足至20mL，加入丙酮60mL，摇匀，放置过夜。取上清液60mL，浓缩干，加水5mL使其溶解，通过已处理好的聚酰胺柱（30～60目，水装柱，25mL），水洗脱2BV，弃去水洗脱液，0.5%碳酸氢钠溶液洗脱5BV，收集洗脱液，用盐酸调pH=5～6，蒸干，残渣加10mL水溶解，作为储备液。

2.2 肿节风多分类部位指纹图谱研究

2.2.1 供试品溶液的制备

2.2.1.1 对照品溶液 称取各对照品化合物适量，用50%甲醇配成约为0.5mg/mL的溶液，作为对照品溶液。

2.2.1.2 供试品溶液 取肿节风多酚类部位储备液经45μm滤膜过滤，作为供试品溶液待用。

2.2.2 色谱条件的优化

2.2.2.1 流动相的确定 参考相关文献[10]，确定流动相系统为乙腈-磷酸-水，采用梯度洗脱，A相为乙腈，B相为0.1%的磷酸水溶液，经比较多种梯度条件，最后确定梯度程序为：0～5min，5% A线性梯度至7.5% A；5～13min，线性梯度至10.0% A；13～25min，线性梯度至15% A；25～30min，线性梯度至17.5% A；30～40min，线性梯度保持17.5% A；40～45min，线性梯度至20%A；45～50min，线性梯度保持20% A；50～55min，线性梯度至80% A。在此条件下，各色谱峰分离度好，保留时间适中。

2.2.2.2 检测波长和流速的确定 采用二极管阵列检测器，得到在190～400nm各波长下的色谱图，最后选定310nm作为检测波长，并记录190～400nm范围内的紫外吸收图。在310nm波长下，各共有色谱峰分离情况良好，且均有较大的吸收峰值。对0.5，0.7，1.0mL/min进行了考察，1.0mL/min条件下色谱峰的峰形与保留时间较好。

2.2.3 方法学考察

附图 各产地肿节风的HPLC图谱（A、B）

附图A 肿节风药材提取液（产地：湖南）

附图B 对照品混合液

2.2.3.1 精密度试验 取湖南药材（批号：2006033008）制备供试品溶液，连续重复进样5次，每次10μL，记录各共有主要峰的保留时间和峰面积，结果显示，各

共有主要峰的保留时间和峰面积的RSD均小于3%。

2.2.3.2 稳定性试验 取精密度试验下供试品溶液分别在0、6、12、18、24、48小时进样分析，并同时记录各共有主要峰的保留时间和峰面积，结果显示，各共有主要峰的保留时间和峰面积的RSD均小于3%。

2.2.3.3 重现性试验 取同一批湖南药材（批号：2006033008）样品5份，制备供试品溶液，在上述色谱条件下分析，并同时记录各共有主要峰的保留时间和峰面积，结果显示，各共有主要峰的保留时间和峰面积的RSD均小于3%。

2.2.4 样品测定 按确定的色谱条件和测定方法，分别对7个供试品进行检测，并同时记录各样品的色谱图和紫外吸收图；在相同的色谱条件下，记录各对照化合物混合样品的色谱图和紫外吸收图。

附表1 各样品HPLC色谱图主要成份峰面积及总峰面积

附表2 不同产地肿节风药材对DPPH自由基清除率及IC50

2.3 抗氧化活性研究

2.3.1 供试品溶液的制备

2.3.1.1 样品溶液 取储备液1mL，分别用95%乙醇稀释至相应的浓度梯度（相当于药材6，2，0.6，0.2，0.06mg/mL）的样品5份。

2.3.1.2 DPPH溶液 称取DPPH适量，用95%乙醇配成2×10-4mol/L的溶液。

2.3.2 DPPH•自由基清除率的测定 分别量取上述供试品溶液与DPPH•溶液各100μL于96孔板中，每个浓度设4个复孔，在摇床上震摇2min，避光反应28min后用酶联免疫仪在517nm下用95%乙醇调零测定吸光值。重复试验3次。

3 结果与讨论

3.1 各产地肿节风药材的HPLC图谱分析。色谱峰的归属：1：3，4-二羟基苯甲酸；2：结构待定；3：绿原酸；4：咖啡酸-4-O-奎宁酸；5：咖啡酸；6：丁香酸；7：咖啡酸-4-O-奎宁酸甲酯；8：咖啡酸-3-O-奎宁酸甲酯；9：异秦皮啶；10：新落新妇苷；11：槲皮素-3-Oα-D-葡萄糖醛酸；12：迷迭香酸-4-Oβ-D-葡萄糖；13：山萘酚-3-O-β-D-葡萄糖醛酸；14：迷迭香酸。

对比对照化合物色谱图与各样品HPLC图谱上相应色谱峰中的保留时间和UV图谱标定了的指纹图谱上的14个特征色谱峰（见附图A、B）。比较各产地药材的HPLC图谱，结果显示，各样品的HPLC图谱显示出，各产地肿节风药材在整体上来说较为相似，主要的色谱峰组成基本一致，成分主要有3类，分别为咖啡酸衍生物、黄酮类和香豆素类。

HPLC图谱提示不同产地的药材在化学成分上存在的差异：①峰面积总和差异：各样品HPLC图谱的总峰面积大小差异显著，其中，锋面积最大的广西药材是锋面积最小的贵州药材的4.15倍（见附表1）。②特征峰差异：广东产药材新落新妇苷（峰10）的色谱峰较明显，而其他产地药材的HPLC图谱中，新落新妇苷的色谱峰很微弱或者根本检测不到。广西产肿节风药材中迷迭香酸（峰14）的峰面积明显较其他产地的药材高，是其他产地药材的3.0～11.3倍。

3.2 肿节风多酚类部位的抗氧化活性 不同浓度的肿节风药材提取液清除DPPH自由基的能力见附表2。由附表2可以看出，肿节风药材具有很强的清除DPPH自由基的能力，在0.03～3mg/mL的浓度范围内，随着提取物浓度的增加，肿节风药材对DPPH自由基的清除能力逐渐增强。

由附表2可知，各产地肿节风药材均显示了较好的抗氧化活性，但不同产地的药材抗氧化活性存在有较大的差异。由于各产地的药材处理方法一致，而且各药材多酚类成分的组成基本相同，因此，各样品的总峰面积可以粗略反映出其中多酚类含量的相对高低，结合附表1可发现，各产地肿节风总多酚类化合物总峰面积的大小与其抗氧化活性强弱基本一致，总峰面积较大的样品抗氧化活性也较强。

本次研究表明，7个不同省份肿节风药材多酚类化合物的成分组成基本相同，成份组成主要有3种类型：咖啡酸衍生物、黄酮类和香豆素类，但色谱图谱上各主要色谱峰的峰面积差异较大。不同产地肿节风药材均有抗氧活性，HPLC图谱总峰面积与抗氧化活性大小基本一致，但不同产地活性大小差异较大，产生的这一差异可能是由于各产地药材天然生长环境、加工及储存等环节的不确定性，导致各产地药材的化学成分和生物活性差异较大。因此，为避免上述可能的影响因素，建议对肿节风进行人工栽培种植，并固定加工储存条件以稳定原药材的质量；企业在采购原药材时应根据需要选择合适产地的原料，固定产地，并对其指纹图谱加以考察控制，以保证产品质量的均一性和稳定性。

综上所述，各企业在选择药材时，一定要针对企业本身具体的需要、各药材本身的品质及有效成分的活性、各不同产地药材的色谱图比较情况等要素，谨慎地选择适合自己企业需要的产地的药材。