超临界CO2状态下酶法合成富含中链脂肪酸的玉米油

齐 颖，陈晓慧，李 越，李志平，于殿宇

（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030）

超临界CO2状态下酶法合成富含中链脂肪酸的玉米油

齐 颖，陈晓慧，李 越，李志平，于殿宇*

（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030）

研究了在超临界CO2状态下，采用脂肪酶催化辛酸与玉米油反应制备富含辛酸甘油酯玉米油的工艺，分别考察了酶用量、反应压力、温度和时间对辛酸酯化率的影响。最佳的工艺条件为:酶用量5%，反应温度60℃，反应时间24h，反应压力11MPa，在此条件下辛酸的酯化率可达到90.73%。反应产物的脂肪酸组成中，具有生理活性的中链脂肪酸含量高达32.00%。

玉米油，辛酸，辛酸酯化率，脂肪酶，超临界CO2

玉米油又称玉米胚芽油，大部分来自加工玉米淀粉糖和生产燃料乙醇的副产品［1］。毛油经过脱酸、脱胶、脱臭、脱色、脱蜡等工艺后制成食用玉米油，其中不饱和脂肪酸含量在80%以上，主要为亚油酸和油酸，亚油酸占油脂总量的50%以上，富含维生素E、磷脂等，是一种高品质的食用油［2］。亚油酸是人体自身不能合成的必需脂肪酸，它具有降低人体胆固醇、降血压、软化血管、预防和改善动脉硬化、减少心脏病发生等作用，并且还可以缓解人体前列腺病症的发作和皮炎的发生。由于天然复合维生素E的功能，玉米油对心脏疾病、血栓性静脉炎、肌萎缩症、营养性脑软化症均有明显的疗效和预防作用。玉米油本身不含有胆固醇，它对于血液中胆固醇的积累具有溶解作用，故能减少对血管产生硬化影响。对老年性疾病如动脉硬化、糖尿病等具有积极的防治作用。近年来国外研究发现，膳食中食用中链或中长链脂肪酸可降低体重和体脂含量、促进能量消耗［3－4］，有些国家甚至明确将中长链脂肪酸相关产品认证为具有特殊功能的保健食品［5］，用中链脂肪酸代替长链脂肪酸可以有效减少健康人体脂肪聚集［6－7］和餐后血甘油三酯水平［8］。由于玉米油中不含有中链的脂肪酸，因此，本文以辛酸和玉米油为原料，对超临界状态下酶法合成富含中链脂肪酸的玉米油进行了初步研究，探讨了反应压力、温度、时间和酶用量对酯化率的影响，为工业生产中有效获得富含中链脂肪酸的玉米油提供了理论基础。在超临界二氧化碳（SC－CO2）状态下进行酶反应，是近年来生物工程新开拓的领域。该状态下的CO2显示出较大的溶解能力和较高传递特性［9］，从而可大大降低酶反应过程的传质阻力，提高酶反应速率;另外，SC－CO2无毒、不可燃、化学惰性佳、易与反应物底物分离。这些优点和特点使其在食品工业上的应用具有广阔的发展前景。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

氢气（纯度＞99.9%）、氮气（纯度＞99.9%） 哈尔滨黎明气体有限公司;辛酸甲酯标准品 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司;脂肪酶Novozym435

自制固定化酶，1340U/g，丹麦诺维信公司;甲醇（色谱纯）、正辛酸（分析纯）、正己烷（色谱纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司;氢氧化钾 分析纯，天津光复精细化工研究所;酚酞 分析纯，天津市东丽区天大化学试剂厂;浓硫酸 固安县清运化工厂;金龙鱼玉米油 嘉里粮油（营口）有限公司。

恒温水浴锅 上海申生科技有限公司;DF－101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市英峪高科仪器厂;低速离心机 北京医用离心机厂;电子分析天平

梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司;7890A型气相色谱仪 安捷伦公司;CP－Sil毛细管柱 美国Varian公司;自制高压釜。

1.2 实验方法

1.2.1 酶促酯化方法 在反应釜中按3∶1的摩尔比加入辛酸与玉米油、同时加入一定量的脂肪酶和转子，将反应釜密封后充入少量CO2以置换出反应釜中的空气，同时试漏，确定反应釜密封情况良好不漏气后，在加压泵的作用下充入CO2使反应釜内达到一定压力，然后将反应釜置于水浴锅中，调节转速至200r/min，在一定温度下反应一定时间。

1.2.2 酯化率的测定分析 取1.2.1中的液体产物3～5滴，称重，采用无水硫酸钠过滤除去水分，以1%H2SO4－甲醇甲酯化［10］后溶于正己烷，供气相色谱分析。辛酸的质量含量通过利用辛酸甲酯标准品绘制的标准曲线算出。

气相分析方法参考Eulitz等人的方法，具体如下:

气相色谱仪:色谱柱:CP－Sil 88毛细管柱（100m×0.25mm I.D.，0.2μm）检测器:FID;进样口温度:250℃;检测器温度:250℃;空气压力:50kPa;氢气压力:60kPa;氮气压力:220kPa;程序升温:70℃时保持4min，然后以 13℃/min的升温速率将温度升至175℃，保持此温度27min，最后以4℃/min的升温速率将温度升至215℃，保持31min。

辛酸酯化率（%）=（M0－Mt）/M0×100%

式中:M0－反应初始体系中辛酸的单位含量;Mt－反应完毕后体系的游离辛酸的单位含量。

1.2.3 甘油酯的纯化 反应完毕后，取出转子，将反应釜内的物质在离心机的作用下离心除去固定化脂肪酶和水。取上述物质溶于正己烷中，加入酚酞指示剂，用0.1mol/L的氢氧化钾－乙醇滴定，直至出现粉红色。加水洗分层，取上层旋转蒸发除去残存的溶剂［11］，得到富含中链脂肪酸的玉米油。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 酶用量对辛酸酯化率的影响 酶用量分别取2%、3%、4%、5%和6%时，反应压力8MPa，反应温度50℃，反应时间15h，酶用量对辛酸酯化率的影响见图1。

由图1可知，随着酶用量的增加辛酸的酯化率也随之提高，但当酶用量达到4%以上时，辛酸酯化率的增加趋势并不明显，同时脂肪酶价格较高，出于成本考虑，酶用量选择4%最为适宜。

2.1.2 反应压力对辛酸酯化率的影响 反应压力分别取8、9、10、11、12MPa 时，酶用量为 4%，反应温度50℃，反应时间15h，反应压力对辛酸酯化率的影响见图2。

图1 酶用量对辛酸酯化率的影响Fig.1 Effects of quantity of enzyme on the esterification rate of lipoic acid

图2 反应压力对辛酸酯化率的影响Fig.2 Effects of reaction pressure on the esterification rate of lipoic acid

由图2可知，压力对脂肪酶本身体系影响不大，主要是它影响了SC－CO2的性质，从而影响反应速率及酯化率［12］。随着反应压力的增加，反应速率加快，从而可相应地缩短反应时间。当压力达到11MPa以上时，辛酸酯化率的提高并不明显，因此反应压力选择11MPa较为适宜。

2.1.3 反应温度对辛酸酯化率的影响 反应温度分别取40、50、60、70、80℃时，酶用量为 4%，反应压力11MPa，反应时间15h，反应温度对辛酸酯化率的影响见图3。

图3 反应温度对辛酸酯化率的影响Fig.3 Effects of reaction temperature on the esterification rate of lipoic acid

由图3可知，当温度从40℃升至60℃时，辛酸的酯化率随之逐渐上升，这说明随着温度的升高，脂肪酶的催化活性部位逐渐暴露，发挥出较强的活性。当温度达到60℃时，脂肪酶催化活性达到极值，之后酯化程度开始下降，这有可能是由于较高温度致使酶部分失活而引起的。可见，Novozym435催化酯化反应的最佳温度在60℃左右。

2.1.4 反应时间对辛酸酯化率的影响 反应时间分别取10、15、20、25、30h 时，酶用量为 4%，反应压力11MPa，反应温度60℃，反应时间对辛酸酯化率的影响见图4。

图4 反应时间对辛酸酯化率的影响Fig.4 Effects of reaction time on the esterification rate of lipoic acid

催化酯化反应过程中，Novozym 435通常所需时间较长，多在20～48h，但反应时间过长会直接影响酶的活力和重复利用。由图4可知，随着反应时间的延长，辛酸的酯化率不断提高，但当反应时间达到20h后上升效果并不显著，这是因为随着反应时间的延长，底物浓度和酶活力开始降低，反应速度逐渐减小，酯化率的增长趋于平缓，体系基本达到平衡。综合考虑反应时间以20h为宜。

2.2 最佳工艺参数的确定

在单因素实验结果基础上，选择反应压力、酶用量、反应温度和反应时间设计4因素3水平正交实验，从而优化超临界CO2状态下酶法合成富含中链脂肪酸的玉米油的反应条件。

表1 正交因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

由表2可知，各因素对辛酸酯化率影响的主次顺序依次为:反应温度＞酶用量＞反应压力＞反应时间。由正交实验得出结果，最优组合为A2B3C2D3，由于正交实验中无此组合，故选取反应条件为反应压力11MPa，酶用量5%，反应温度60℃，反应时间24h的组合做验证实验，实验结果证明此条件下辛酸的酯化率可达到90.73%。

表2 正交实验结果Table 2 Result of orthogonal experiment

2.3 辛酸的GC分析

辛酸甲酯标准品、富含辛酸甘油酯的玉米油GC分析结果如图5和图6所示。

图5 辛酸甲酯标准品的GC图Fig.5 GC figure of Lipoic methyl standard

图6 富含辛酸甘油酯的玉米油GC图Fig.6 GC figure of corn oil rich in lipoic glyceride

由图5可知，辛酸甲酯的标准品保留时间为13.383min。在反应产物的 GC图中，辛酸在13.322min时出现，含量为32.00%，即反应产物的脂肪酸组成中，具有生理活性的脂肪酸含量高达32.00%。

3 结论

在超临界CO2状态下酶法合成富含辛酸甘油酯的玉米油，通过单因素和正交实验的研究，确定了最佳的制备工艺:酶用量5%，反应温度60℃，反应时间24h，反应压力11MPa，在此条件下辛酸的酯化率可达到90.73%。此方法合成的辛酸甘油酯属天然、绿色的结构脂质，为工业生产中有效地获得富含中链脂肪酸的玉米油提供了理论基础。

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Enzymatic synthesis of corn oil rich in
medium chain fatty acid in supercritical CO2state

QI Ying，CHEN Xiao－hui，LI Yue，LI Zhi－ping，YU Dian－yu*
（School of Food Science and Technology，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

The preparation of corn oil rich in medium chain fatty acid by lipase－catalyzed in supercritical CO2was studied，this response was synthesized from conjugated lipoic acid and corn oil.The effects of the quantity of enzyme，the reaction pressure，temperature and time on the esterification rate of lipoic acid were studied.The results showed that the optimal parameters were as follows:the quantity of enzyme 5%，reaction temperature 60℃，reaction time 24h，reaction pressure 11MPa.Under these conditions，the esterification rate of lipoic acid reached 90.73%.The content of medium chain fatty acid which had physical activities was 32.00%in the products.

corn oil;lipoic acid;the esterification rate of lipoic acid;lipase;supercritical CO2

TS225.1+9

B

1002－0306（2012）02－0300－04

2011－03－02 *通讯联系人

齐颖（1985－），女，在读硕士，研究方向:粮食、油脂及植物蛋白工程。

国家863高技术研究发展计划（2010AA101503）。