肉苁蓉提取液对NO2-清除作用的体外实验研究

林 敏，张 鑫，吴冬青，安红钢，任雪峰

（甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室，河西学院，甘肃张掖 734000）

肉苁蓉提取液对NO2-清除作用的体外实验研究

林 敏，张 鑫，吴冬青，安红钢，任雪峰

（甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室，河西学院，甘肃张掖 734000）

研究肉苁蓉水浴浸提物与超声辅助浸提物在体外模拟胃液pH条件下清除亚硝酸根的最佳提取工艺。结果表明，水浴浸提最佳工艺条件为:80%的乙醇溶剂，水浴温度80℃，料液比1∶20，浸提时间120min;超声辅助浸提的最佳提取条件为:80%的乙醇溶剂，30℃的超声温度，料液比1∶20，超声时间20min，超声功率60Hz;在反应时间8min，浓度为0.0720g/mL时，水浴浸提物与超声辅助浸提物对NO－2的清除率分别为99.33%和84.21%。肉苁蓉对亚硝酸根有很强的清除能力，并随着浓度的增加清除作用加强，且水浴提取物对亚硝酸根清除作用显著高于超声辅助浸提物。

肉苁蓉，提取，NO－2清除作用，体外实验

肉苁蓉（Cistanche deserticola Y.C.Ma），又称大芸、金笋、地精。为列当科植物，味甘咸，性温和有补肾壮阳、益精血、润肠道通便、强筋壮骨等功能，有入药、泡酒等多种食用方法。药用价值仅次于人参，有“沙漠人参”美誉［1－2］，主产于我国内蒙、新疆、甘肃、宁夏、青海等省（区）以及伊朗、蒙古、印度等国。它是一种古老的中草药，首次记载于《神农本草经》中，将其列为上品，中国药典规定正品为干燥带鳞叶的肉质茎。根据现代科学实验分析证明:肉苁蓉已分离出多种类型的物质，主要可分为苯乙醇苷类、环烯醚萜类、木脂素类、多糖、生物碱等［3］。具有降低外周血管阻力、降压、抗脂肪肝和抗肿瘤等多种药理活性［4－5］。由于亚硝酸根是生成 N－亚硝基化合物的前提物，后者具有较强的致突变和致癌性［6］。因此，食用过量亚硝酸盐可引起食物中毒，对人体健康产生潜在的危害［7］。如果某种物质具有清除亚硝酸盐或其前体的作用，那么这种物质就可能具有防癌的作用［8］。亚硝酸盐与胺类化合物在酸性环境下或细菌作用下容易形成N－亚硝基化合物，有强烈的致癌性［9］。肉苁蓉提取液的组成复杂，其中可能含有VC、多酚、黄酮类化合物、多糖等［10］，这些成分对清除亚硝酸盐有重要作用［11－14］。但肉苁蓉提取液清除亚硝酸根及其影响因素的研究鲜见文献报道，本文就此进行了实验研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

肉苁蓉（大芸） 采集于甘肃省靖远县，洗净，风干，粉碎过60目筛，备用;5×10－4mol/L NaNO［15］2标准溶液，pH=2的柠檬酸三钠－盐酸溶液，5×10－4mol/L的甲基紫水溶液。

KQ－3200DB型数控超声波清洗仪 河南巩义市英峪工业区;WFJ2100型可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限责任公司;GB204型电子天平 上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂;SHB－Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 亚硝酸根自由基的检测及最佳波长的测定在25mL的容量瓶中依次加入0.75mL 5×10－4mol/L的甲基紫，5mL pH 2的柠檬酸三钠－盐酸缓冲液，稀释至25mL摇匀，静置10min后用1cm比色皿以蒸馏水作参比，测定吸光度A1，同样，在另一25mL容量瓶中先加入NO2－，再依次加入0.75mL 5 ×10－4的甲基紫，5mL pH 2的柠檬酸三钠－盐酸缓冲液，稀释至25mL摇匀，静置10min后置于1cm比色皿以水作参照，测量吸光度A3，计算甲基紫吸光度的减小值（ΔA=A1－A3）。测定出最佳吸收波长。

1.2.2 ΔA与NaNO2用量工作曲线的绘制 精密吸取 NaNO2溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL，然后依次加入5mL柠檬酸三钠－盐酸缓冲液，0.75mL甲基紫溶液，定容至25mL静置10min在最佳波长下测定其吸光度，并计算ΔA，绘制ΔA与NaNO2用量曲线。

1.2.3 清除率的测定 精密吸取一定量肉苁蓉提取液，然后依次加入 0.70mL NaNO2溶液，0.75mL 5×10－4的甲基紫，5mL pH=2的柠檬酸三钠－盐酸缓冲液，稀释至25mL摇匀，静置10min后用1cm比色皿以蒸馏水作参比，测量吸光度A2。

亚硝酸根自由基清除率d的计算方法如下:

式中:A1－甲基紫吸光度;A2－加肉苁蓉提取液测得的吸光度;A3－未加肉苁蓉提取液测得的吸光度。

1.2.4 肉苁蓉样液的单因素提取实验 以肉苁蓉为实验材料，以回流乙醇浓度、浸提时间、料液比、水浴温度为单因素进行实验。以肉苁蓉提取物生料含量对亚硝酸根的清除效果为指标，所有实验均重复三次。

1.2.4.1 水浴回流法提取条件对肉苁蓉提取物对亚硝酸根清除率的影响 乙醇浓度对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响:每组称取2.000g肉苁蓉，乙醇浓度分别取50%、60%、70%、80%、90%，在水浴温度70℃下，料液比为 1∶10，回流 120min，抽滤，定容在50mL容量瓶中，570nm波长下测其吸光度，研究乙醇浓度对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根能力的影响。

提取时间对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响:实验方法同上，每组提取时间分别为60、90、120、150、180、210min，其余条件不变，研究提取时间对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响。

料液比对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响:实验方法同上，每组料液比分别为 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，其余条件不变，研究料液比对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响。

提取温度对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响:实验方法同上，分别在 50、60、70、80、90℃温度下回流120min，其余条件不变，研究提取温度对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响。

水浴回流法提取工艺的正交优化实验:为了对水浴回流法提取工艺进行深入的研究，选择提取温度、乙醇浓度、提取时间、料液比四因素进行正交实验，方法同上，正交因素水平见表1。以提取物对亚硝酸根的清除率为指标，研究各因素对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根能力的影响，从而确定最佳的提取工艺条件。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Orthogonal factor level table

1.2.4.2 超声辅助法提取工艺条件对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响 超声功率对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响:每组称取2.000g肉苁蓉，加入80%乙醇，料液比为1∶20，浸泡120min，温度为30℃，分别在频率为 40、50、60、70、80Hz 下，超声 20min，抽滤，定容在50mL瓶中，在570nm波长下测其吸光度，研究不同超声功率对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根效果的影响，实验中每个样品重复三组，结果取平均值。

超声温度对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响:实验方法同上，每组超声温度分别为25、30、40、50、60、70℃，其余条件不变，超声 20min，研究超声温度对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响。

超声时间对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响:实验方法同上，每组超声时间分别为10、20、30、40、50、60min，其余条件不变，研究超声时间对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响。

乙醇浓度，料液比对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响与回流法相同。

1.2.5 反应时间对其清除亚硝酸根的影响 每组称取2.000g肉苁蓉，乙醇浓度为80%，料液比为1∶10，在80℃下回流120min，抽滤，定容在50mL容量瓶中，在570nm波长下测其吸光度时分别反应2、4、6、8、10、12min，探究不同反应时间对其清除亚硝酸根效果的影响。

2 结果与分析

2.1 波长的选择［15］

由图1可见，在该实验条件下加入NO－2后甲基紫的最大吸收峰在580nm，在570nm处ΔA最大，因此，选570nm处测量波长。

2.2 ΔA与NaNO2用量工作曲线的绘制

图1 最佳波长的选择Fig.1 Optimal wavelength selection

分别精密吸取 NaNO2溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL，然后依次加入 5mL 柠檬酸三钠－盐酸缓冲液，0.75mL甲基紫，定容至25mL静置10min在570nm最佳波长下测定其吸光度，并计算 ΔA=A－A'，得到回归方程为 y=0.4351x－0.0050，相关系数R=0.9995。其中，A为不加 NaNO2的吸光度值，A'为加入不同体积NaNO2的吸光度值。

图2 ΔA与亚硝酸钠用量工作曲线Fig.2 Working curve of ΔA and the amount of NaNO2

2.3 水浴回流法提取工艺条件对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响

2.3.1 乙醇浓度对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响 从表2可知，当乙醇浓度为80%时，提取物对亚硝酸根的清除效果最好，随着乙醇浓度的进一步升高，提取物清除亚硝酸根的能力反而降低。因此，本实验选择80%的乙醇浓度为最佳提取浓度。

表2 乙醇浓度对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响Table 2 The effect of ethanol concentration onNO2－eliminating of Herba Cistanches extract

2.3.2 提取时间对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响 从表3可知，当提取时间在120min时，提取物对亚硝酸根的清除效果最好，随着时间的延长，提取物清除亚硝酸根的能力基本持平。因此，本实验选择120min为最佳提取时间。

表3 提取时间对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响Table 3 The effect of extraction time onNO2－eliminating of Herba Cistanches extract

2.3.3 料液比对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响 从表4可知，当料液比为1∶20时，提取物对亚硝酸根的清除效果最好，随着料液比的进一步增大，干扰也变大，因此本实验选择1∶20为最佳料液比。

表4 料液比对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响Table 4 The effect of solid－liquid ratio on NO2－eliminating of Herba Cistanches extract

2.3.4 水浴温度对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响 从表5可知，当水浴温度80℃，提取物对亚硝酸根的清除效果最好，随着温度的进一步升高，提取物清除亚硝酸根的能力基本持平。因此，本实验选择80℃为最佳提取温度。

表5 水浴温度对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响Table 5 The effect of water bath temperature on NO2－eliminating of Herba Cistanches extract

2.3.5 水浴回流法提取工艺的正交优化实验 由表6可知，经极差分析，各因素对提取物清除亚硝酸根效果影响的主次顺序依次为:乙醇浓度＞料液比＞浸提时间＞提取温度。

表6 L9（34）正交实验结果Table 6 Orthogonal test results

综合以上单因素实验、正交实验结果与分析，从实用性和节能等角度考虑，选择最佳提取工艺条件为A2B2C2D2，即80%的乙醇溶剂，80℃的水浴温度，料液比1∶20，浸提时间120min，在最佳提取工艺条件下进行验证实验，肉苁蓉提取液对亚硝酸根的清除率为80.03%，高于正交实验各组的结果，说明最佳提取工艺条件是可信的。

2.4 超声辅助法提取工艺条件对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响

在上述最佳提取工艺条件下，对比研究超声辅助浸提对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响。

2.4.1 超声功率对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响 从表7可知，当超声频率为60Hz时，提取物对亚硝酸根的清除效果最好，随着频率的进一步增加，提取物清除亚硝酸根的能力先下降，后又基本持平。因此，综合考虑本实验选择60Hz为最佳超声频率。

表12 抗坏血酸对亚硝酸盐的清除率Table 12 The NO2－clearance of ascorbic acid

表7 超声功率对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响Table 7 The effect of ultrasonic power on NO2－eliminating of Herba Cistanches extract

2.4.2 超声温度对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响 从表8可知，当超声温度为30℃时，提取物对亚硝酸根的清除效果最好，随着温度的进一步升高，提取物对亚硝酸根的清除效果，变化不明显，基本持平。因此，综合考虑本实验选择30℃为最佳超声温度。

表8 超声温度对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响Table 8 The effect of ultrasonic temperature on NO2－eliminating of Herba Cistanches extract

2.4.3 超声时间对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响 从表9可知，当超声时间为20min时，提取物对亚硝酸根的清除效果最好，随着时间的进一步延长，提取物清除亚硝酸根的能力基本持平，变化不明显。因此，本实验选择20min为最佳超声时间。

表9 超声时间对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响Table 9 The effect of ultrasonic time on NO2－eliminating of Herba Cistanches extract

2.5 反应时间对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响

从表10可知，当反应时间为8min时，提取物对亚硝酸根的清除率最大，随着时间的延长，清除率几乎不变。因此，本实验选择反应时间为8min为宜。

表10 反应时间对肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的影响Table 10 The effect of reaction time on NO2－eliminating of Herba Cistanches extract

2.6 两种提取液和抗坏血酸对亚硝酸根清除率的比较

从表11可知，肉苁蓉提取液对亚硝酸根的清除率随其用量增加而增大，且两者存在线性关系，水浴提取液体积对亚硝酸根清除率的线性方程为:Y=95.665V+20.2655，相关系数为0.9767;超声提取液体积对亚硝酸根清除率的线性方程为:Y=81.765V+11.0735，相关系数为0.9996;当用量增加到0.9mL时，即浓度为0.0720g/mL时，水浴提取液对亚硝酸根的清除率最大可达到99.33%。超声辅助浸提液对亚硝酸根的清除率可达到84.21%。

表11 肉苁蓉水浴提取液与超声提取液对亚硝酸根的清除效果（%）Table 11 The NO2－clearance of water extract and ultrasonic extract of Herba Cistanches（%）

从表12可知，2%的抗坏血酸对亚硝酸根的清除率随其用量增加而增加，且两者存在线性关系，Y（清除率）=83.1357V+38.5014，相关系数为0.9859;当用量增加到0.8mL时对亚硝酸根的清除率可达到100%。

3 讨论

3.1 一定量的肉苁蓉样品，在采用单因素变量法研究肉苁蓉提取物清除亚硝酸根的最佳提取工艺条件下，当生料浓度一致时，仅从其对NO－2清除率方面考虑，水浴回流法明显比超声辅助法清除率高。但从能源消耗角度和省时角度来说，超声辅助法更优越。

3.2 肉苁蓉提取物的最佳提取方法为水浴回流法，其最佳工艺条件是:80%的乙醇溶剂，80℃的水浴温度，料液比1∶20，浸提时间120min;在反应时间8min，0.9mL（0.0720g/mL）样液，其对 NO－2的清除率可达99.33%。由于提取温度对亚硝酸根清除率的影响最小，从节能角度考虑，选70℃的水浴温度不会对NO－2的清除率产生太大影响。

采用超声辅助法的最佳工艺条件是:80%的乙醇溶剂，30℃的超声温度，料液比1∶20，超声时间20min，超声功率60Hz;在反应时间 8min，同样取0.9mL样液，其对NO－2的清除率达到84.21%。

3.3 肉苁蓉对亚硝酸根有较强的清除能力，当其提取液用量为0.9mL（0.0720g/mL），清除率几乎已接近100%，与0.8mL 2%的抗坏血酸对亚硝酸根的清除率相当，其清除机理有待进一步研究。

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Effect of Herba Cistanches extract on NO2－eliminating in vitro experiment

LIN Min，ZHANG Xin，WU Dong－qing，AN Hong－gang，REN Xue－feng
（Key Laboratory of Hexi Corridor Resources Utilization of Gansu Province，Hexi University，Zhangye 734000，China）

Herba Cistanches as material，the best extract crafts eliminating NO2－were studied in simulated gastric pH conditions.The results showed that the best conditions of extract of water bath were ethanol concentration 80%，extracted temperature 80℃，ratio of material to liquid 1∶20，extracted time 120min，and the best conditions of extract of ultrasonic extraction were ethanol concentration 80%，30℃，power 60Hz，time 20min，ratio of material to liquid 1∶20.In the condition of the concentration of 0.0720g/mL and reaction time 8min，the scavenging rate of NO2－were 99.33%and 84.21%respectively for extract of water bath and ultrasonic.Herba Cistanche had the fortissimo ability to scavenge NO2－.The scavenging effects increased with the increasing of concentration.The scavenging ability of the extract of water bath to NO2－was much better than that of ultrasonic.

Herba Cistanches;extraction;eliminating of NO2－;in vitro experiment

TS201.1

A

1002－0306（2012）02－0126－05

2010－08－30

林敏（1967－），女，副教授，研究方向:天然产物有效成分提取与分析。

甘肃省教育厅资助项目（1009－09）;甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室科研资助项目（xz1008）。