大豆多糖对S180荷瘤小鼠抗肿瘤作用的免疫机制研究

张秀娟，刘 斌，孙宇婷，季宇彬

（哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心生物安全评价研究所，

国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，黑龙江哈尔滨 150076）

大豆多糖对S180荷瘤小鼠抗肿瘤作用的免疫机制研究

张秀娟，刘 斌，孙宇婷，季宇彬

（哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心生物安全评价研究所，

国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，黑龙江哈尔滨 150076）

从免疫学角度出发探讨大豆多糖的抗肿瘤作用。采用动物移植性肿瘤实验观察大豆多糖对小鼠体内肿瘤细胞生长和免疫器官胸腺、脾脏的影响;MTT法测定T淋巴细胞增殖功能;流式细胞仪检测大豆多糖对S180荷瘤小鼠T淋巴细胞亚群的影响;ELISA法检测荷瘤小鼠血清中细胞因子IL－2含量。结果表明大豆多糖对S180肉瘤生长有抑制作用，且以高剂量最佳;各剂量组对脾脏指数均有显著性提高，但中、高剂量给药组对胸腺有抑制作用;能提高小鼠脾淋巴细胞的增殖活性，与阴性对照组相比，中、高剂量组差异显著。大豆多糖明显增强ConA刺激的淋巴细胞增殖，与阴性对照组比较，中、高剂量组差异显著;能够不同程度地提高S180荷瘤小鼠脾细胞CD4+细胞数，增加CD4+/CD8+细胞比值;能提高S180荷瘤小鼠外周血血清中IL－2的含量。大豆多糖通过提高T淋巴细胞的增殖活性，并促进IL－2等细胞因子的分泌，由此发挥抗肿瘤作用。

大豆多糖，抗肿瘤，T淋巴细胞，CD分子，IL－2

据《本草纲目》记载，大豆有除痈肿、逐水胀、长肌肤、填骨髓等作用。从豆渣中提取的可溶性大豆多糖（SSPS）具有多种生物学功能，主要表现在膳食纤维上，可以有效预防肥胖症、结肠癌、高血压、心脏病和动脉硬化，可以增强人体的免疫能力［1－2］。目前主要用于食品行业的研究与应用，而对大豆多糖的生物学活性的药物研究还很少，因此本文以纯度为95%的大豆多糖为研究对象，探讨大豆多糖的抗肿瘤作用和其免疫调节机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

昆明种小鼠 18～22g，雌雄兼用，普通级，购于哈尔滨医科大学附属肿瘤医院动物养殖中心，动物合格证号:SCXX（黑）2006－008）;肉瘤S180购于哈尔滨医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所;大豆多糖 纯度95%，上海百奥特植物蛋白科技有限公司;刀豆蛋白A Sigma公司;RPMI1640培养粉 Gibco公司;四氮唑蓝 MTT Sigma公司;DMSO 天津市光复精细化工研究所，批号20080723;Anti－mouse－PE－CD8单克隆抗体、Anti－mouse－FITC－CD4 单克隆抗体 Multisciences Biotech Co.，Ltd.;小鼠白介素－2（IL－2）试剂盒 美国RND公司进口分装。

Sartorius BS110S型万分之一电子天平 德国BSS;SANYO MC0175型CO2培养箱 日本三洋公司;CKX－41－32倒置显微镜 Olympus公司;JJT－900/1300超净工作台 苏净集团;SUNRISE酶标仪 瑞士TECAN公司;CLOUTER EPICS－XL流式细胞仪 美国Beckman－Coulter公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大豆多糖对S180荷瘤小鼠瘤重的影响

1.2.1.1 建立小鼠肿瘤模型 S180肉瘤腹水接种10d的种鼠，取少量腹水，加生理盐水稀释成1∶3的瘤细胞悬液，按0.2mL/只接种S180肉瘤于小鼠右前肢腋下。

1.2.1.2 实验动物分组和给药 50只昆明小鼠，随机分成5组，每组10只，雌雄各半。小鼠荷瘤接种后24h给各组S180荷瘤小鼠分别腹腔注射给药，分为阴性对照组:生理盐水;大豆多糖给药组:高剂量组（150mg/kg·d）、中剂量组（100mg/kg·d）、低剂量组（50mg/kg·d）;阳性对照组:环磷酰胺 CTX（25mg/kg·d），给药剂量为 0.2mL/只·d，连续给药10d，停药次日处死动物。

1.2.1.3 测定抑瘤率 停药次日处死，分别称取小鼠体重、瘤块重，计算肿瘤抑制率［4］。

抑瘤率（%）=（对照组平均瘤重－实验组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%

1.2.2 大豆多糖对S180荷瘤小鼠胸腺指数和脾指数的影响 小鼠肿瘤模型的建立、实验动物分组及给药同1.2.1，连续给药10d，停药次日处死动物。分别剥取小鼠胸腺和脾脏，由下式计算:

胸腺指数=平均胸腺重（mg）/平均体重（g）;脾指数=平均脾重（mg）/平均体重（g）。

1.2.3 大豆多糖对S180荷瘤小鼠细胞免疫功能的影响

1.2.3.1 实验动物模型制造方法及给药剂量与途径同1.2.1。

1.2.3.2 脾淋巴细胞的制备 停止给药24h后，处死动物，收集脾细胞于离心管中，以1500r/min离心10min，弃上清液。脾细胞悬液用10倍体积的Tris－NH4Cl溶液重悬，37℃预温，静置4min，裂解红细胞，1000r/min离心5min得白细胞液。再次用Hanks液洗涤2次，RPMI－1640培养液（10%胎牛血清）稀释细胞成2×106/mL，置4℃冰箱备用。

1.2.3.3 每只小鼠的细胞悬液均分为对照孔和ConA孔，各设三个复孔。于96孔板每孔加入细胞悬液100μL，对照孔加 100μL RPMI－1640，ConA 孔加100μL ConA（终浓度为 10μg/mL），37℃，5%CO2培养箱孵育培养48h，取出培养板，每孔加入 MTT（5mg/mL）10μL，继续培养 4h，取出去上清，每孔加入DMSO 150μL，吹打混匀，孵育10min，酶标仪测定570nm处OD值。

T淋巴细胞刺激指数SI=ConA刺激孔平均OD值/对照孔平均OD值

1.2.4 大豆多糖对S180荷瘤小鼠T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+的影响 实验动物模型制造方法及给药剂量与途径按1.2.1进行;停止给药后24h处死小鼠，制备脾淋巴细胞。采用直接免疫荧光标记法染色，按浓度取1.0×106个细胞200μL至1.5mL EP管，2000r/min离心5min，去上清液，分别加入稀释好的荧光标记抗小鼠CD4、CD8的单克隆抗体各100μL混匀，同时设空白对照组和单加CD4、CD8抗体的对照组，便于仪器调零处理。4℃避光30min，加入1mL PBS缓冲液洗涤，2000r/min离心5min，去上清液，加入PBS重悬细胞，加入1%多聚甲醛0.4mL固定30min，混匀，流式细胞仪检测。

1.2.5 大豆多糖对S180荷瘤小鼠外周血清中IL－2含量的影响 实验动物模型制造方法及给药剂量与途径按1.2.1进行;停药24h后，眼球采血，室温凝固30min，2000r/min离心10min，收集血清，ELISA 酶联免疫检测法测定。

1.2.6 统计学分析 用SPSSl5.0软件处理，数据用表示，样本比较采用方差检验。

2 结果与分析

2.1 大豆多糖对S180荷瘤小鼠瘤重的影响

大豆多糖对S180荷瘤小鼠肿瘤抑制效果如表1所示，与生理盐水比较，大豆多糖三个剂量组对肿瘤细胞生长均有抑制作用，且各组差异显著，与阳性药环磷酰胺相比，大豆多糖低、中剂量组差异显著，高剂量组有差异。

表1 大豆多糖对S180荷瘤小鼠肿瘤重量的影响（，n=10）Table 1 The effect of SSPS on tumor weight ofmice with RBC S180（，n=10）

表1 大豆多糖对S180荷瘤小鼠肿瘤重量的影响（，n=10）Table 1 The effect of SSPS on tumor weight ofmice with RBC S180（，n=10）

注:与阴性对照组比较，*P＜0.05;＊＊P＜0.01，表2～表4同;与阳性对照组比较★P＜0.05;★★P＜0.01。

组别 给药剂量（mg/kg·d）瘤重（g）抑制率（%）阴性对照组 －1.0036±0.0788 －CTX 25 0.2464±0.0308 75.45低剂量组 50 0.6666±0.0363＊＊★★ 33.58中剂量组 100 0.5983±0.0416＊＊★★ 40.38高剂量 150 0.4171±0.0481＊＊★58.44

2.2 大豆多糖对S180荷瘤小鼠胸腺指数和脾指数的影响大豆多糖对S180荷瘤小鼠胸腺指数和脾指数的影响如表2所示，与阴性对照组比较，大豆多糖各给药组胸腺指数都显著提高，且各剂量组差异显著，低剂量组高于中、高剂量组，可能随着给药量的增加，

对胸腺的增长起抑制作用。

2.3 大豆多糖对S180荷瘤小鼠细胞免疫功能的影响

大豆多糖对S180荷瘤小鼠淋巴细胞增殖的影响如表3所示，与阴性对照组比较，大豆多糖各给药组能提高淋巴细胞的增殖活性，其中，中、高剂量组差异显著，大豆多糖给药组也能明显增强ConA刺激的淋巴细胞增殖的效果，与阴性对照组比较，中、高剂量组差异显著。另外，低剂量组分别与中、高剂量组比较，差异显著。

表2大豆多糖对S180荷瘤小鼠胸腺指数的影响（，n=10）Table 2The effect of SSPS on thymus index of mice with RBC S180（，n=10）

表2大豆多糖对S180荷瘤小鼠胸腺指数的影响（，n=10）Table 2The effect of SSPS on thymus index of mice with RBC S180（，n=10）

组别 给药剂量（mg/kg·d） 胸腺指数（mg/g） 脾指数（mg/g）阴性对照组 －1.2925±0.1341 4.9302±0.6368低剂量组 50 3.1498±0.3619＊＊ 6.6749±0.4345*中剂量组 100 2.6559±0.2210＊＊ 7.7092±0.5309＊＊高剂量 150 2.2194±0.1609＊＊ 8.7322±0.4991＊＊

表3大豆多糖对S180荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖的影响（，n=5）Table 3The effect of SSPS on T lymphocyte proliferation of mice with RBC S180（，n=5）

表3大豆多糖对S180荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖的影响（，n=5）Table 3The effect of SSPS on T lymphocyte proliferation of mice with RBC S180（，n=5）

组别 给药剂量（mg/kg·d） OD570值 +ConA值 增值指数阴性对照组 －0.2408±0.0237 0.3148±0.0374 1.3073低剂量组 50 0.2453±0.0261 0.3283±0.0301 1.3384中剂量组 100 0.4448±0.0271＊＊ 0.6610±0.0457＊＊ 1.4861高剂量 150 0.4790±0.0579＊＊ 0.7160±0.0743＊＊1.4948

2.4 大豆多糖对S180荷瘤小鼠T淋巴细胞亚群数量影响

由图1可见，当肿瘤发生时，与阴性对照组相比，CD4+水平降低，CD4+/CD8+比值明显降低，机体以负调节占优势。与阴性对照组相比，大豆多糖各给药组均能提高CD4+水平，中、高剂量组能提高CD4+/CD8+比值，说明大豆多糖能提高其细胞免疫功能，具有免疫增强作用，另外给药组还能一定程度的提高CD8+水平，其表达水平超过正常组水平。

图1 大豆多糖对S180荷瘤小鼠T淋巴细胞亚群CD4+和CD8+影响Fig.1 SSPS to the effect of CD4+and CD8+on mice with RBC S180for the T lymphocyte subsets

2.5 大豆多糖对S180荷瘤小鼠外周血清中IL－2含量的影响

由表4可见，与阴性对照组比较，大豆多糖各给药组均能提高S180荷瘤小鼠外周血血清中IL－2的含量，且中、高两个剂量组与对照组相比差异极显著。

表4 大豆多糖对S180荷瘤小鼠外周血清中IL－2含量的影响（，n=3）Table 4 The effect of SSPS on IL－2 in serum of mice with RBC S180（，n=3）

表4 大豆多糖对S180荷瘤小鼠外周血清中IL－2含量的影响（，n=3）Table 4 The effect of SSPS on IL－2 in serum of mice with RBC S180（，n=3）

组别 给药剂量（mg/kg·d） IL－2 含量（pg/mL）阴性对照组 －24.4625±4.1170低剂量组 50 39.5386±4.9840中剂量组 100 152.9533±28.8488＊＊高剂量 150 190.9379±43.9723＊＊

3 讨论与结论

移植性肿瘤实验是体内常用的抗肿瘤药物筛选方法［3］，通过S180肿瘤细胞腋下移植实验，采用腹腔注射给药方法，测定大豆多糖体内抗肿瘤作用效果。结果表明:大豆多糖高、中、低各剂量组小鼠腋下肿瘤重量均明显低于阴性对照组，且各组均呈现显著性差异，说明大豆多糖对S180荷瘤小鼠肿瘤细胞有一定的抑制作用。

免疫器官脏器指数是衡量机体免疫功能的初步观察指标［4］。研究结果显示，与阴性对照组相比大豆多糖给药组能显著提高小鼠的胸腺和脾脏重量，且组间也具有显著性差异，但随着给药剂量增加，中、高剂量组对胸腺有明显抑制作用。初步说明，增强免疫功能是大豆多糖抗肿瘤的可能途径之一。淋巴细胞的增殖和分化是机体免疫应答过程中的一个重要阶段，淋巴细胞受到抗原或促有丝分裂原刺激时，增殖能力的强弱反映了淋巴细胞功能的高低。利用MTT法测定淋巴细胞增殖功能，ConA作为T淋巴细胞有丝分裂原，促进T淋巴细胞的增殖。结果证明，大豆多糖能提高淋巴细胞的增殖活性，也能增强ConA刺激的淋巴细胞增殖的效果，且各剂量组效果显著。机体抗肿瘤特异性免疫反应以T细胞介导的免疫应答为主［5］。成熟的T细胞根据其细胞膜表面表达的抗原性糖蛋白分子分为CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞两个亚群，二者之间相互影响、相互调节，保持CD4+/CD8+值相对稳定，维持机体正常的免疫功能。淋巴细胞亚群比例上升或下降，反映机体免疫功能发生相应变化，当肿瘤发生时，CD4+/CD8+T细胞比值会降低，说明机体的免疫状态失衡，呈负相免疫调节。结果显示，大豆多糖能够不同程度地提高S180荷瘤小鼠脾细胞CD4+、CD8+细胞数，增加CD4+/CD8+细胞比值，说明大豆多糖具有提高荷瘤小鼠免疫力的功能。IL－2并不是直接杀灭肿瘤细胞活性，其抗肿瘤机理在于刺激、活化其效应细胞，间接发挥抗肿瘤作用。研究中发现肿瘤的形成可使小鼠体内IL－2的产生不同程度的下降，从而干预了免疫系统的抗肿瘤功能，以利于肿瘤的生长。结果显示，大豆多糖各剂量组能提高荷瘤小鼠血清中的IL－2含量。综上所述，大豆多糖抗肿瘤机制是通过调节机体免疫功能实现的。

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［5］李冰，张学成，高美华，等.钝顶螺旋藻藻蓝蛋白和多糖的抗肿瘤免疫活性研究［J］.中国海洋大学学报，2004，34（3）:396－402.

Effects of soybean polysaccharide on antitumor and immunological mechanism of mice bearing S180

ZHANG Xiu－juan，LIU Bin，SUN Yu－ting，JI Yu－bin
（Institute of Biosafety evaluation，Research Center on Life Sciences and Environmental Sciences，Harbin University of Commerce，Engineering Research Center of Natural Anticancer Drugs，Ministry of Education，Harbin 150076，China）

To study the effect of soybean polysaccharides（SSPS）on antitumor and immune regulation of mice bearing S180.The effect of SSPS on antitumor and spleen index and thymus index were observed by tumor transplant experiment of animal;MTT examines T－lymphoid cell proliferation of the mice of tumor cell with S180;Adopting flow cytometry to determine T cell faciation;Use the ELISA method to examine the serum level of IL－2 in tumor mice.SSPS can inhibit the growth of S180and the effect of high dose group was best.The spleen index was influenced by every dose group but thymus index was inhibited by middle and high dose;it can enhance the T cell proliferation after the ConA provok and has significantly difference.SSPS can enhance the CD4+T cell number in different extent，increase the CD4+/CD8+cell ratio;SSPS can obviously enhance the serum level of IL－2，have significantly difference.SSPS had the notable anti－tumor，increased T－lymphoid cell proliferation，and promoted IL－2 secreting thus played its anti－tumor role.

soybean polysaccharides;antitumor;T－lymphocytes;CD molecule;IL－2

TS201.4

A

1002－0306（2012）02－0389－04

2011－01－04

张秀娟（1962－），女，教授，博士，从事肿瘤药理研究工作。

黑龙江省自然科学基金项目（D201043）。