黑曲霉脂肪酶合成单月桂酸甘油酯

邓颖颖，杨 哪，徐学明，2，*

（1.江南大学食品学院，江苏无锡214122；2.食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122)

黑曲霉脂肪酶合成单月桂酸甘油酯

邓颖颖1，杨 哪1，徐学明1，2，*

（1.江南大学食品学院，江苏无锡214122；2.食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122)

从黑曲霉中提出了一种具有很高催化活性和选择性的脂肪酶，为证明这种脂肪酶的高选择性，用此酶直接催化甘油和月桂酸反应合成单月桂酸甘油酯，并且优化了反应的工艺参数。实验表明，采用甘油月桂酸摩尔比为1∶1.5，脂肪酶与底物质量比为0.5%，水与底物质量比为3%的条件在50℃下反应12h，可使月桂酸转化率达到91.2%，单酯含量高达70%。

黑曲霉脂肪酶，月桂酸单甘酯，合成

脂肪酸单甘酯是一种高效的表面活性剂，能够起乳化、起泡、分散、消泡、淀粉抗老化等作用，广泛应用于食品领域，是食品中应用最为广泛的一种乳化剂[1]。脂肪酸单甘酯的合成方法主要有化学法和酶法。与化学合成法[2-3]相比，酶法反应条件温和、能耗低、选择性高，具有工业化潜力。酶法合成主要有两种途径：一是用脂肪酶甘油解牛油、棕榈油等[4]，但单甘酯含量不超过30%，且反应周期长，产品纯化处理极其困难；二是用脂肪酶直接催化脂肪酸或酯与甘油反应，但很多酶[5-6]选择性很差，产物中单酯含量不高，Novozyme435[7-9]虽然具有很好的选择性，但是价格昂贵，不利于工业化生产。目前酶法合成存在的问题主要是酶的选择性差，单酯产量不高；或者昂贵，很难商业化。因此，寻找选择性高、能商业化生产的酶是酶法合成脂肪酸单甘酯的研究重点。本实验室从黑曲霉中提取的脂肪酶经初步实验证明具有很强的催化活性和选择性，是合成脂肪酸单甘酯的有效催化剂。本文以此酶催化月桂酸和甘油反应，以证明它的高活性和选择性，并对反应进行了优化，为工业化酶法生产高含量单酯提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

黑曲霉脂肪酶（比酶活：60.3U/mg） 实验室；月桂酸、甘油、无水乙醚、无水乙醇、氢氧化钠、高碘酸、硫代硫酸钠 中国医药集团上海公司，分析纯。

8S-1型磁力搅拌器 江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂；501型超级恒温水浴锅 上海实验仪器厂；分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；岛津20AT液相色谱仪 Shimadzu公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶催化酯化反应 称取约5.32mmol月桂酸，加入一定量的甘油于100mL的酶反应器中，再加入所需要的水，在50℃下搅拌0.5h，至反应物混合均匀时加入一定量的酶进行反应。

1.2.2 月桂酸转化率的测定[7]反应结束后，从反应混合物中取样0.1g左右（精确到0.1mg），并用10mL溶剂（无水乙醇∶无水乙醚=2∶1）溶解，用0.05mol/L的氢氧化钠标准溶液滴定残余的脂肪酸，计算脂肪酸转化率。

式中：m1、m2为反应前、后称取的样品质量（g）；V1、V2为反应前、后滴定所用氢氧化钠的量（mL）。

1.2.3 单月桂酸甘油酯含量的测定[10]反应结束后，从中取出0.07～0.1g（精确到0.2mg）反应物，用25mL氯仿将其溶解，在过量高氯酸的存在下，用高碘酸-硫代硫酸钠氧化还原滴定，测定出总甘油单酯质量分数。

式中：M为单月桂酸甘油酯的质量分数；V0为滴定空白所用硫代硫酸钠的量（mL）；V1为滴定样品所用硫代硫酸钠的量（mL）；C为硫代硫酸钠浓度（mol/L）；G为称取样品的质量（g）。

1.2.4 液相色谱分析[11]色谱柱：Welch Vltimate AQC18（5μm，250mm×4.6mm，i.d）；检测器：Waters 2410型示差折光检测器。称取100mg样品溶于10mL有机溶剂中（甲醇∶正己烷=90∶10），经0.45μm微孔滤膜过滤后，作为分析样品，进样量10μL，流动相为甲醇∶正己

烷（90∶10，V∶V），流速0.5mL/min，柱温34℃。

2 结果与讨论

2.1 反应产物的组分分析

甘油月桂酸摩尔比为1∶1，脂肪酶与底物质量比为1%，水与底物质量比为3%，在60℃下反应16h得到的产物用液相色谱分析，结果如图1、图2所示。由图1～图2可知该酶能较好地合成单月桂酸甘油酯（7.438min）和少量的月桂酸二酯（11.034min），选择性好。

图1 单月桂酸甘油酯标样的HPLC图Fig.1 HPLC of standard lauric acid monoglyceride

图2 单月桂酸甘油酯样品的HPLC图Fig.2 HPLC of synthetic lauric acid monoglyceride

2.2 甘油月桂酸摩尔比对月桂酸转化率的影响

为考察甘油与月桂酸摩尔比对月桂酸转化率的影响，选取脂肪酶与反应底物质量（甘油和月桂酸总质量）比0.5%、温度50℃、反应时间12h、初始水量与反应底物质量比3%进行实验，考察不同甘油月桂酸摩尔比对反应的影响。结果如图3所示。

图3 甘油月桂酸摩尔比对转化率的影响Fig.3 Effect of ratio of glycerol to lauric acid on conversion rate

月桂酸单甘酯的合成过程是界面反应，从化学平衡看，底物摩尔比增加对底物的最终转化率无明显影响，并且，底物摩尔比的增加对最终产物的分离纯化产生不利影响。由图3可知，随甘油月桂酸摩尔比的增加，月桂酸的转化率无明显变化，最终的转化率都可达到90%左右，实验结果与理论相符。在本实验中，甘油和月桂酸的摩尔比为1∶1.5时，底物浓度相对于酶的活性中心已经过量，达到了较高的转化率，故以后实验中均选取甘油月桂酸摩尔比为1∶1.5。

2.3 反应时间对月桂酸转化率和单酯含量的影响

在甘油月桂酸摩尔比1∶1.5、脂肪酶与反应底物质量比0.5%、初始水量与反应底物质量比3%，在50℃的条件下进行反应，考察不同反应时间下的月桂酸转化率及单酯含量。结果如图4所示。

图4 反应时间对转化率和单酯含量的影响Fig.4 Effect of reaction time on conversion rate and content of lauric acid monoglyceride

由图4可知，随着时间的延长，月桂酸转化率在不断增大，在12h时月桂酸转化率已经达到90.2%，12h到20h之间月桂酸转化率没有明显变化；单酯含量随时间延长也在不断增大，12h时达到最大值71.4%。

2.4 反应温度对月桂酸转化率和单酯含量的影响

在甘油月桂酸比1∶1.5、脂肪酶与反应底物质量比0.5%、反应时间12h、初始水量与反应底物质量比3%条件下，研究温度对转化率及单酯含量的影响。结果如图5所示。

图5 反应温度对转化率和单酯含量的影响Fig.5 Effect of reaction temperature on conversion rate and content of lauric acid monoglyceride

由图5表明，反应温度对月桂酸转化率和单酯含量的影响很大，在酶的稳定范围之内，升温能加快反应进程，但温度过高，酶会失活。在反应体系中，月桂酸与甘油不能混溶，反应是界面反应，受传质及底物接触面积的影响，升高温度有利于传质，两种底物同时与酶接触的机会大大增加，有利于酯化反应的进行。正如图5所示，转化率和单酯含量随温度升高不断增大，在50℃时达到最大值。在80℃时由于酶的迅速失活，转化率和单酯含量都降低。

2.5 加酶量对月桂酸转化率和单酯含量的影响

利用甘油月桂酸摩尔比1∶1.5、初始水量与反应物质量比3%、在50℃、反应12h的情况下，考察脂肪酶与反应底物质量比对转化率及单酯含量的影响。结果如图6所示。

图6 脂肪酶与反应底物质量比对转化率和单酯含量的影响Fig.6 Effect of ratio of lipase to substrates on conversion rate and content of lauric acid monoglyceride

由图6可知，月桂酸转化率和单酯含量都随着脂肪酶用量的增大而增大，当用量达到0.5%时，月桂酸转化率达90%，单酯含量70%，继续增加脂肪酶用量，转化率和单酯含量变化不明显。

2.6 初始水量对转化率的影响

在甘油月桂酸摩尔比为1∶1.5、脂肪酶与底物质量比为0.5%、反应时间12h、55℃的反应条件下，研究初始水量与反应底物质量比对月桂酸转化率的影响。结果如图7所示。

由图7可知，起初月桂酸转化率随初始水量的增加而增大，3%时到达最大，随后转化率有下降的趋势。这可能是由于脂肪酶催化的酶促反应需要适量的水分激活其活性，而酯化反应是脱水反应，水是产物之一，水分过多会使反应提前达到平衡，使转化率降低。

图7 初始水量对转化率的影响Fig.7 Effect of ratio of water to substrates on conversion rate

3 结论

本实验验证了从黑曲霉中提取的脂肪酶具有很强的催化活性和选择性，可直接催化甘油和月桂酸合成脂肪酸单甘酯，这种方法工艺过程简单无污染，成本低，脂肪酸转化率和产物中单酯含量很高，具有很好的应用前景。实验还确定了反应的最佳工艺参数：甘油月桂酸摩尔比为1∶1.5，脂肪酶与底物质量比为0.5%，水与底物质量比为3%，反应温度50℃，反应时间为12h，此时月桂酸转化率为91.2%，单酯含量高达70%。

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[6]Wiphum Kaewthong，Sarote Sirisansaneeyakul，Poonsuk Prasertsan，et al.Continuous production of monoacyl glycerols by glycerolysis of palm olein with immobilized lipase[J].Process Biochemistry，2005（40）：1525-1530.

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Aspergillus niger lipase-catalyzed synthesis of high content lauric acid monoglyceride

DENG Ying-ying1，YANG Na1，XU Xue-ming1，2，*
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；
2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Wuxi 214122，China）

A lipase from Aspergillus niger has been found with strong catalytic activity and selectivity.In order to prove the lipase high selectivity，it was used to catalyze the fatty acids and glycerin synthetic fatty acid glyceride and optimize the reaction process parameters.The results showed that when the ratio of glycerol to lauric acid 1∶1.5，the lipase dosage 0.5%（W/W），the water dosage 3%（W/W）based on the reactant which was employed in the reacting system，the conversion rate of lauric acid could reach 91.2%at 50℃for 12h reaction. The content of lauric acid monoglycerid was about 70%in the reacting production.

Aspergillus niger lipase；lauric acid monoglyceride；synthesis

Q814.9

A

1002-0306（2012）09-0209-03

2011－07－08 *通讯联系人

邓颖颖（1987-），女，硕士研究生，研究方向：食品物性与组分。