采用响应面法优化杏鲍菇菌丝体多糖提取工艺

冮 洁，刘 冰

（大连民族学院生命科学学院，辽宁大连116600）

采用响应面法优化杏鲍菇菌丝体多糖提取工艺

冮 洁，刘 冰

（大连民族学院生命科学学院，辽宁大连116600）

采用响应面法对杏鲍菇菌丝体胞内多糖的提取工艺进行优化。在单因素实验的基础上，以多糖得率为响应值，确定了实验参数的水平范围。结果表明：液固比、浸提温度、浸提时间和乙醇用量等因素对多糖得率的影响具显著性；杏鲍菇菌丝体多糖提取的最佳工艺参数为：液固比30∶1mL/g、浸提温度97℃、浸提时间1.8h、乙醇用量是浸提液的2.5倍，浸提1次，在该工艺条件下杏鲍菇菌丝体多糖得率为8.65%。

杏鲍菇，菌丝体，多糖，提取，响应面法

杏鲍菇（Pleurotus eryngii）是真菌门、担子菌亚门、真担子菌纲、伞形目、侧耳科、侧耳属真菌，是大型肉质菌[1]。杏鲍菇肉质肥厚，味道鲜美，兼有鲍鱼和杏仁的香味，是一种很受消费者欢迎的食用菌。杏鲍菇营养丰富，经常食用具有降血脂、降胆固醇、促进胃肠消化、增强机体免疫力的功效[2-3]。杏鲍菇真菌多糖不仅存在于子实体中，其菌丝体也是多糖的主要来源，并且液态深层发酵具有生产周期短、生长条件易控制、产量高等优点[4]。目前杏鲍菇多糖开发多集中在子实体多糖上，杏鲍菇菌丝体多糖的开发研究相关报道甚少。金周雨等对杏鲍菇菌丝体多糖培养条件进行了优化[5]。为深入开发利用这一珍稀食（药）用菌资源，本文对杏鲍菇菌丝体胞内多糖的提取条件进行了研究，在单因素实验的基础上，采用响应面法对杏鲍菇液体培养菌丝体所产胞内多糖的提取工艺进行优化，确定杏鲍菇菌丝体胞内多糖提取工艺的最佳参数，为其进一步的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

杏鲍菇（Pleurotus eryngii） 购自朝阳市食用菌研究所；斜面培养基（PDA培养基） 马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉20g、水1000mL，pH自然；液体培养基 液体PDA培养基；葡萄糖、琼脂粉、浓硫酸、苯酚、无水乙醇 均为分析纯或化学纯。

PL203电子精密天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DNP-9082电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司；无菌操作台 苏州净化设备有限公司；UV-2000紫外可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；THZ-C-1恒低温气浴摇床 上海丰盟科技材料有限公司；HH-S水浴锅 巩义市英峪仪器一厂；MLS-3750高压灭菌锅 日本三洋；TDZ5-WS离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化 将保存菌种用接种针接入斜面培养基中，25℃恒温培养7d。

1.2.2 菌丝体液体种子培养 在PDA液体培养基中接入斜面菌体，培养温度28℃，摇床转速150r/min，培养5～7d。

1.2.3 菌丝体液体发酵 将种子液按10%接种量接入PDA液体培养基中，培养温度28℃，150r/min摇床培养5～7d。将发酵液过滤获得菌丝体，用蒸馏水洗涤2次，60℃烘干后粉碎过60目筛子，备用。

1.2.4 多糖提取实验方法 称取上述杏鲍菇菌丝体干粉，加适量蒸馏水，在一定温度下水浴浸提一定时间，过滤，滤液适当浓缩，加适量乙醇，混匀，置4℃冰箱中过夜，取出后4000r/min离心20min，弃去上清液，所得沉淀用乙醇反复洗涤3次，60℃烘干，得粗多糖，测定粗多糖中多糖含量。

采用响应面法优化多糖提取工艺，实验设计的因素水平如表1所示。

表1 响应面实验因素水平表Table 1 The factors and levels of respond surface analysis

1.2.5 多糖的测定 采用苯酚-硫酸法[6]。

多糖得率（%）=多糖含量/菌体干重×100%

2 结果与分析

2.1 杏鲍菇菌丝体多糖提取单因素实验

2.1.1 液固比的确定 从多糖得率与液固比的关系图（图1）中可以看出，随着液固比的不断增加，浸提出的多糖量逐渐增加，多糖得率也显著增加，但当液固比达20∶1（mL/g）之后，大部分多糖已被浸提出来，再增加浸提液体积，多糖得率增长缓慢，从经济和操作体积方面考虑，选择液固比在10∶1～30∶1（mL/g）为宜。

图1 液固比对多糖得率的影响Fig.1 The effect of liquid to solid ratio on the polysaccharide yield

2.1.2 浸提温度的确定 从多糖得率与浸提时间的关系图（图2）中可以看出，随着浸提温度的不断提高，多糖得率也显著增加，但当浸提温度达90℃以上后，多糖得率增长缓慢，由于在常压下浸提易于操作，如温度超过100℃，还需进行加压，故选择浸提温度在80～100℃之间。

图2 浸提温度对多糖得率的影响Fig.2 Theeffectofextractiontemperatureonpolysaccharideyield

2.1.3 浸提时间的确定 从多糖得率与浸提时间的关系图（图3）中可以看出，随着浸提时间的不断增加，多糖得率也显著加大，但当浸提时间超过2h后，由于大部分多糖已被浸提出来，多糖得率增长缓慢，故选择浸提时间在1～3h。

图3 浸提时间对多糖得率的影响Fig.3 The effect of extraction time on polysaccharide yield

2.1.4 乙醇用量的确定 从多糖得率与乙醇用量的关系图（图4）中可以看出，随着乙醇用量的不断增加，浸提出的多糖量逐渐增加，多糖得率也显著加大，但当乙醇用量是浸提液的2倍后，多糖得率增长缓慢，故选择乙醇用量是浸提液的1～3倍。

图4 乙醇用量对多糖得率的影响Fig.4 The effect of the volume of ethanol on polysaccharide yield

2.2 响应面法优化杏鲍菇菌丝体多糖提取工艺实验设计及结果

根据液固比、浸提温度、浸提时间、乙醇用量4个单因素实验所确定的水平范围，以多糖得率为响应值，采用Disign-Expert软件中的Box-Behnken Design（BBD）实验设计方法设计了4因素3水平共29个实验点的响应面实验。表2为响应面实验设计和实验结果数据表。

为了处理数据的方便，各因素水平化为函数。水平变换公式如下：

液固比：A=（a-20）/10

浸提温度：B=（b-90）/10

浸提时间：C=c-2

乙醇用量：D=d-2

a、b、c、d均为实际水平，A、B、C、D则为参与分析的逻辑水平。

表2 响应面优化实验设计表和实验结果Table 2 The experimental design and results of RSM

表3 响应面优化实验回归模型系数表Table 3 The regression coefficients of polynomial model

图5 各因素交互作用对多糖得率的影响Fig.5 The effect of experimental factors interaction on polysaccharides extraction

Y=8.07+0.76A+0.40B+0.44C+1.09D-0.21AB-0.22AC-0.24AD-0.038BC-0.17BD-0.24CD-0.33A2-0.13B2-0.45C2-0.94D2

由表4方差分析得知，回归模型的F-检验极显著（P≤0.01），说明所拟合的二次回归方程合适。回归方程的A（液固比）、B（浸提温度）、C（浸提时间）、D（乙醇用量）、A2、C2、D2对多糖得率的影响显著（P≤0.01）。根据回归方程，做出响应面图（图5），直观地反映了各因素交互作用对响应值的影响。图5所拟合的响应曲面的形状，抛物面开口向下，说明所拟合的回归模型有极大值点。从上述回归模型中求得最优条件列于表5。

表4 实验结果方差分析表Table 4 The variance analysis of experimental results

表5 响应面优化实验预测最优条件Table 5 The predict optimal conditions using response surface experiment

预测多糖得率最大值8.66%。由表6可见实际与预测的多糖得率较为接近。

3 结论

杏鲍菇是近年来开发的食用和药用价值都很高的珍稀食用菌，但其子实体生产周期长、产率低、价格高，如从子实体中提取多糖物质，成本较高，从而影响杏鲍菇多糖的开发生产，而利用液体深层发酵生产真菌多糖活性物质，具有生产周期短、生长条件易控制、产量高等优点。研究杏鲍菇菌丝体多糖的发酵和提取，可为深入开发利用这一珍稀食（药）用菌资源提供参考。本文首先通过单因素实验，确定了杏鲍菇菌丝体多糖提取参数的适宜水平范围，然后，采用响应面法对杏鲍菇菌丝体胞内多糖的提取工艺进行优化。获得杏鲍菇菌丝体多糖提取的最佳工艺参数为：液固比30∶1、浸提温度97℃、浸提时间1.8h、乙醇用量是浸提液的2.5倍，提取1次，在该工艺条件下杏鲍菇菌丝体多糖得率达8.65%。

表6 响应面优化实验最佳工艺条件的验证Table 6 The validation experiments for optimum technological conditions

[1]熊彪，曹洋.硒对杏鲍菇菌丝生长的影响[J].食品工业科技，2008，29（2）：164-166.

[2]李波，芦菲，南海娟，等.杏鲍菇保健饮料的研制[J].食品工业科技，2009，30（4）：229-231.

[3]颜明娟，江枝和，蔡顺香.杏鲍菇营养成分的分析[J].食用菌，2002（2）：11-12.

[4]盛伟，方晓阳.杏鲍菇菌丝体胞内与胞外多糖体外抗氧化活性研究[J].中国林副特产，2009（1）：7-10.

[5]金周雨，李艳丽，王雪.杏鲍菇菌丝体水溶性多糖提取及培养条件优化[J].菌物研究，2009，7（2）：109-112.

[6]宁慧青.不同食用菌多糖含量的比较研究[J].山西化工，2007，6（3）：16-18.

Optimization of extraction conditions of polysaccharides from Pleurotus eryngii mycelium using response surface methodology

GANG Jie，LIU Bing
（College of Life Sciences，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China）

The extraction conditions for Pleurotus eryngii mycelial polysaccharide were optimized using response surface methodology（RSM）.On the basis of single factor experiments，the yield of polysaccharide as response value，the test parameter level range was determined.The results showed that the factors of liquid to solid ratio，extraction temperature，extraction time and volume of ethanol significant effect on the yield of polysaccharides.The optimal parameters of polysaccharides extraction from Pleurotus eryngii mycelium were as follows：the ratio of liquid to solid 30∶1（mL/g），extraction temperature 97℃，extraction time 1.8h，the volume of ethanol to extraction liquid 2.5 times，extraction once，and under the optimal conditions，the yield of Pleurotus eryngii mycelium polysaccharide extraction reached 8.65%.

Pleurotus eryngii；mycelium；polysaccharides；extraction；response surface methodology

TS201.1

B

1002-0306（2012）09-0256-04

2011－07－28

冮洁（1965-），女，博士，教授，研究方向：食品生物技术。

财政专项-中央高校基本科研业务费资助项目（DC10020106）。