ε-聚赖氨酸与葡聚糖美拉德反应初级阶段产物的乳化性研究

2012-10-24 08:47房子舒高彦祥
食品工业科技 2012年9期
关键词:聚赖氨酸共价葡聚糖

闫 冰,房子舒,高彦祥,袁 芳

(中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083)

ε-聚赖氨酸与葡聚糖美拉德反应初级阶段产物的乳化性研究

闫 冰,房子舒,高彦祥,袁 芳*

(中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083)

采用美拉德干热反应制备ε-聚赖氨酸-葡聚糖共价复合物并制备乳液,通过浊度、粒径及稳定性分析,研究了反应温度、湿度、时间、反应物混合比和pH对共价复合物乳化性及乳化稳定性的影响。褐变程度及接枝度结果表明,ε-聚赖氨酸和葡聚糖发生了美拉德反应。以乳化性改善为主要指标,ε-聚赖氨酸/葡聚糖质量比1∶15,在pH8.5,相对湿度为65%,60℃条件下,干热反应1~3d产物的乳化性及乳化稳定明显改善,反应1d复合物乳化性较好且褐变程度较小,接枝度约26.4%。以乳化稳定性改善为指标,ε-聚赖氨酸/葡聚糖质量比1∶10,反应1d最佳。

ε-聚赖氨酸,葡聚糖,美拉德反应,乳化性,褐变指数

ε-聚赖氨酸(ε-polylysine,ε-PL)因在体内可降解为易于人体吸收的赖氨酸,并具有良好的抗菌性和热稳定性而受到广泛关注[1-2]。但Hiraki[3]发现,ε-聚赖氨酸易与蛋白质和酸性多糖发生相互作用,从而导致其抑菌性能的降低,且ε-聚赖氨酸乳化性较差,因而ε-聚赖氨酸的应用限制于淀粉基类食物。葡聚糖(dextran,DE)已广泛作为食品工业中的增稠剂和稳定剂[4]。已有研究利用葡聚糖与酪蛋白[5]、大豆蛋白[6]、大米蛋白[7]等发生美拉德反应改善蛋白质的乳化性、溶解性等功能特性。Ho[8]等发现ε-聚赖氨酸与葡聚糖美拉德干热反应产物在中性pH和高NaCl浓度(1.0mol/L)有较好的乳化性,并保留抑菌性。谢建飞[9]等研究表明,ε-聚赖氨酸与葡聚糖美拉德湿热反应产物具有较好的乳化性和抑菌性。但关于不同干热反应条件对ε-聚赖氨酸与葡聚糖复合物乳化性和乳化稳定性的影响的报道较少。本文旨在研究各种影响因素(反应温度、湿度、时间、反应物质量比和pH)对ε-聚赖氨酸-葡聚糖干热共价复合物乳化性及乳化稳定性的影响,除采用浊度法[10],还采用Nano zetasizer粒径分析仪、Turbiscan Lab Expert浓缩体系稳定性分析仪快速评价乳液乳化性及稳定性,为ε-聚赖氨酸与葡聚糖共价复合物乳化剂开发提供理论依据,通过测定褐变程度及接枝度分析产物结构变化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

ε-聚赖氨酸 浙江银象生物工程有限公司;葡聚糖(分子质量4万) 国药集团化学试剂有限公司;葵花籽油 中粮集团有限公司;邻苯二甲醛(OPA) 国药集团化学试剂有限公司;β-巯基乙醇 美国Amresco;碘化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、甲醇、十二烷基磺酸钠(SDS)、硼砂 均为分析纯。

T25Digital高速剪切仪 德国IKA公司;NS1001L2K型高压均质机 意大利Niro-Soavi公司;Zetasizer Nano-ZS90激光粒度仪 英国Malvern公司;Turbiscan Lab Expert浓缩体系稳定性分析仪 法国Formulation公司;UV-1800紫外可见分光光度仪 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 ε-聚赖氨酸与葡聚糖共价复合物的制备 将ε-聚赖氨酸与葡聚糖以质量比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20溶解于pH8.5 1/15mol/L磷酸盐缓冲液中,常温磁力搅拌1h。溶液冷冻干燥后,将冻干粉置于底部盛有饱和溴化钾(相对湿度79%)、饱和碘化钾(相对湿度65%)的干燥器中,分别采用40、60、80℃反应1~4d,在不同反应时间取样,所得产物置于-20℃冰箱中储存。

1.2.2 乳化性测定 参考Pearce和Kinsella[10]方法的基础上略微改进,采用浊度法测定乳化性。称取1.2.1中制备的样品0.1g溶于50mL去离子水,制备2g/L质量浓度的样品溶液,取45mL样品溶液,加入15mL葵花籽油,经高速剪切仪在12000r/min下剪切1min,立即从溶液底部吸取100μL乳浊液,用1g/L的SDS溶液稀释至10mL,以SDS溶液为空白,以即时测定的500nm处吸光度A500nm表示乳化性。实验重复测定三次。

1.2.3 乳状液制备 取1.2.1中样品溶解于95mL pH7.0 1/15mol/L磷酸盐缓冲液中,制备20g/L样品溶液,搅拌至完全溶解形成水相。在高速剪切仪的搅拌下,缓慢将5mL葵花籽油加入水相中,以8000r/min剪切10min,再通过高压均质机(一、二级均质压力分别为5、50MPa)均质三次得到乳状液。

1.2.4 乳状液粒径分析 取1.2.3中制备的乳状液50μL,用去离子水稀释1000倍至50mL,采用Zetasizer Nano-ZS90激光粒度仪室温分析乳液粒径大小,以平均粒径(nm)和多分散系数(Polydispersity Index,PdI)表示。实验重复测定三次。

1.2.5 乳状液物理稳定性快速评价 采用Turbiscan Lab Expert浓缩体系稳定性分析仪对乳状液的稳定性进行快速分析。仪器采用脉冲近红外光源(λ= 880nm)自下而上扫描样品,两个同步光学探测器分别搜集透射光和背散射光。在一定时间内连续扫描样品,获得透射光与背散射光信号对样品高度的函数曲线图,即可反映出样品中颗粒运动趋势,进而预测出纳米乳状液的稳定性。实验选用背散射光值(Delta BS)和稳定性系数来分析乳状液的稳定性,取1.2.3中制备的20mL乳状液置于Turbiscan测试瓶中(样品高度约为45mm),将测试瓶放入检测池中,温度设定为30℃,每10min扫描一次,扫描4h,记录扫描图谱。实验重复测定三次。

1.2.6 褐变指数测定 参照文献[11-12],并加以改进。取1.2.1制备的样品0.2g溶于10mL去离子水,制备20g/L的样品溶液,以去离子水做空白,测定溶液在420nm下的吸光值A420nm,表示褐变程度。实验重复测定三次。

1.2.7 自由氨基测定及接枝度(Degree of graft,DG)的计算 采用改进OPA法[13]对蛋白质中自由氨基进行测定。试剂一:准确称取40mg的邻苯二甲醛(OPA)溶解于1mL甲醇,加入3mL去离子水,混匀后保存于棕色试剂瓶中备用。试剂二:20g/100mL的SDS 2.5mL,0.1mol/L硼砂25mL,及100μL β-巯基乙醇,用去离子水定容到50mL,混匀后置于棕色试剂瓶中备用。测定时,分别取0.30mL试剂一与3.70mL试剂二于试管中混匀,注入200μL一定浓度的样品液(本实验中为1.2.1中样品溶于去离子水制备的8g/L样品溶液),混匀后于35℃反应2min,340nm下测其吸光值A340nm。用200μL去离子水代替样品液作为空白。以赖氨酸做出标准曲线,根据A340nm计算样品中自由氨基的含量C。接枝度DG(%)=(C0-Ct)/C0×100%,式中,C0为未反应时蛋白质自由氨基总量,Ct为反应t时刻蛋白质自由氨基的含量。实验重复测定三次。

2 结果与讨论

2.1 反应相对湿度对ε-聚赖氨酸-葡聚糖复合物乳化性和褐变指数的影响

图1 相对湿度对乳化性和褐变指数的影响Fig.1 Effect of relative humility on emulsifying activity and browning index

将冻干粉样品分别置于底部盛有饱和溴化钾(RH 79%)、饱和碘化钾(RH 65%)的干燥器中,60℃反应24h。如图1,RH 79%产物乳化性略大于RH 65%产物。一般来说,温度较高和相对湿度较大时形成的共价复合物乳化性较好[14]。但是RH 79%产物褐变程度高,观察形成透明发亮的粘性胶状物,且溶解度较低。这可能由于ε-聚赖氨酸吸湿性强[1],在相对湿度较高时迅速吸湿导致美拉德反应剧烈,反应程度不易控制。故本实验采用饱和碘化钾(RH 65%)控制反应相对湿度,以控制共价复合物的反应程度及褐变程度,形成具有良好功能性质的共价复合物。

2.2 反应温度对ε-聚赖氨酸-葡聚糖复合物乳化性和褐变指数的影响

将冻干粉样品分别置于40、60、80℃,RH 65%反应24h。如图2,ε-聚赖氨酸-葡聚糖在80℃反应1d后产物褐变程度迅速升高,乳化性下降,可能由于反应温度过高导致反应速度过快,褐变程度加深,且温度过高容易引起蛋白质变性,导致乳化性降低。故美拉德反应温度一般选择40~60℃,低于蛋白质的变性温度[14]。ε-聚赖氨酸与葡聚糖在60℃产物乳化性优于40℃,褐变指数较小,这可能由于较高但较温和的反应温度促进美拉德反应。Ho[8]等认为美拉德反应在50℃以上进行可以显著改善ε-聚赖氨酸-葡聚糖复合物的乳化性。故本实验采用60℃控制干热反应温度。

图2 反应温度对乳化性和褐变指数的影响Fig.2 Effect of reaction temperature on emulsifying activity and browning index

2.3 反应时间对ε-聚赖氨酸-葡聚糖复合物的影响

2.3.1 反应时间对ε-聚赖氨酸-葡聚糖复合物乳化性和褐变指数的影响 将ε-聚赖氨酸与葡聚糖(质量比1∶15)冻干粉样品置于60℃,RH 65%条件,分别在6、12、18h、1、2、3、4d取样。如图3,随着反应进行,ε-聚赖氨酸-葡聚糖复合物褐变程度加深,反应1d褐变指数较小,反应3d褐变指数迅速提高。随着反应进行,复合物乳化性呈现先增大后减小的趋势,6h内乳化性迅速提高,反应3d时乳化性最佳,这可能由于ε-聚赖氨酸与葡聚糖发生共价交联,由于葡聚糖的亲水性使得复合物的表面活性得到提高。反应3d后随着反应时间的延长复合物乳化性降低,可能由于反应时间过长导致复合物过于亲水,使得其表面活性降低,从而降低了复合物的乳化性[7,15],也可能由于反应时间过长进入美拉德反应高级阶段[14]。由于反应1~3d乳化性变化不大,而褐变指数显著增大,因此ε-聚赖氨酸与葡聚糖(质量比1∶15)在60℃,RH 65%反应条件下,选取反应时间1d样品最佳。

图3 反应时间对乳化性和褐变指数的影响Fig.3 Effect of reaction time on emulsifying activity and browning index

2.3.2 反应时间对ε-聚赖氨酸-葡聚糖复合物乳液粒径和多分散系数的影响 粒径是评价乳状液性能最重要的指标之一,包括粒径大小和粒径分布,两者直接影响乳状液的稳定性及产品的感官性状、功能特性、货架期等[16]。ε-聚赖氨酸、葡聚糖、ε-聚赖氨酸-葡聚糖混合物冻干粉粒径分别为3612、2018、2567nm,多分散系数均为1.000(图中未标出)。如图4,随着反应时间延长,ε-聚赖氨酸-葡聚糖复合物制备乳液粒径呈现先减小后略增大的趋势。反应6h后产物制备乳液粒径显著下降,反应1d后粒径最小,在反应1~3d,随着反应时间延长,粒径略有增大但增幅不显著,这与上文浊度法测定乳液乳化性结论一致。ε-聚赖氨酸-葡聚糖共价复合物与混合物冻干粉、ε-聚赖氨酸、葡聚糖相比,乳液粒径显著减小,这说明ε-聚赖氨酸-葡聚糖经过共价复合后粒径减小,乳化性提高。多分散系数(Polydispersity Index,PdI)表示乳液粒径分布,PdI值越小说明乳液越稳定[17]。反应6h后PdI值显著减小,反应3d后乳液PdI值最小,约为0.097。

图4 反应时间(反应6h后)对乳液粒径和多分散系数的影响Fig.4 Effect of reaction time(after 6h)on emulsion droplet size and polydispersity index

2.3.3 反应时间对ε-聚赖氨酸-葡聚糖复合物乳化稳定性的影响 图5是Turbiscan快速稳定性分析仪扫描4h得到背散光强度变化百分比Delta BS与样品池高度对应图。不同样品制备乳液扫描4h后顶部和底部均发生变化,底部出现澄清层,顶部出现乳析层,粒子有向上迁移的趋势。这是由于乳状液是热力学不稳定体系,随着贮藏会出现絮凝、聚集及乳析等现象。Delta BS绝对值越小,乳液稳定性越好[18]。如图5(a)、5(b),Turbiscan稳定性分析仪扫描4h后,ε-聚赖氨酸制备乳液顶部及底部ΔBS值约为12%、-15%,ε-聚赖氨酸-葡聚糖冻干粉制备乳液顶部及底部ΔBS值为18%、-10%,样品池中部曲线不重合,说明样品乳液粒径变化较大,乳液不稳定。如图5(c),ε-聚赖b:ε-聚赖氨酸-葡聚糖混合物冻干粉(质量比1∶15,0h);c:ε-聚赖氨酸-葡聚糖共价复合物(质量比1∶15,60℃,12h);d:ε-聚赖氨酸-葡聚糖共价复合物(质量比1∶15,60℃,1d)。氨酸-葡聚糖共价复合物(反应12h)制备乳液顶部及底部ΔBS值为10%、-5%;乳液粒径变化较小;如图5(d),ε-聚赖氨酸-葡聚糖共价复合物(反应1d)制备乳液顶部及底部ΔBS值为4%、-4%,且样品池中部曲线重合,粒径几乎不变。证明ε-聚赖氨酸-葡聚糖共价复合物(质量比1∶15),60℃反应1d后乳化稳定性大大提高,在油水界面上能以适宜的构象排列,具有较好的乳化特性。采用Turbiscan快速稳定性分析仪扫描图谱得到的稳定性系数评价乳液稳定性。乳液稳定性系数是样品Delta BS变化的偏差值,稳定性系数越小,样品体系就越稳定。如图6,反应1~4d产物乳液稳定性系数与ε-聚赖氨酸、葡聚糖相比显著减小,且1~4d稳定性系数变化不大。如图7,由Turbiscan在3.5h时的扫描图谱可得,ε-聚赖氨酸、葡聚糖、ε-聚赖氨酸-葡聚糖0h混合物稳定性系数分别约为8.7、6.2、5.3;随着反应进行,1~4d产物制备乳液稳定性系数下降至0.3,乳液体系逐渐稳定。

图5 样品制备乳液Turbiscan扫描图谱Fig.5 Turbiscan profiles of emulsions prepared with samples注:a:ε-聚赖氨酸;

图6 Turbiscan测定反应时间对样品乳液稳定性系数的影响(扫描210min)Fig.6 Effect of reaction time on Turbiscan stability index measured by Turbiscan scanning for 210min

图7 Turbiscan测定反应时间对样品乳液稳定性系数的影响(在3.5h扫描)Fig.7 Effect of reaction time on Turbiscan stability index measured by Turbiscan scannning on 3.5h

2.3.4 反应时间对ε-聚赖氨酸-葡聚糖复合物反应物接枝度的影响 如图8,随着反应时间延长,体系中自由氨基减少,接枝度提高,反应1d后接枝度约26.4%,反应4d接枝度约43.2%。蛋白质与多糖的反应是建立在两者活性基团的充分暴露和相互接触的基础之上[19],葡聚糖是多糖,分子量较大,只有一个还原性末端,而且由于多支链结构而存在着一定的空间位阻,致使葡聚糖的反应活性较低,往往需要经过一段时间才能与ε-聚赖氨酸相结合。随着反应时间的延长,ε-聚赖氨酸的氨基与葡聚糖的醛基受热逐步结合,反应程度提高。

图8 反应时间对接枝度的影响Fig.8 Effect of reaction time on degree of graft

2.4 反应物质量比对ε-聚赖氨酸-葡聚糖复合物的影响

2.4.1 反应物质量比对ε-聚赖氨酸-葡聚糖复合物乳化性褐变程度的影响

图9 反应物质量比对乳化性和褐变指数的影响Fig.9 Effect of weight ratio of dextran to ε-polylysine on emulsifying activity and browning index

图10 Turbiscan测定反应物质量比对稳定性系数的影响(在4h时扫描)Fig.10 Effect of weight ratio of ε-polylysine to dextran on Turbiscan stability index measured by Turbiscan scannning on 4h

将ε-聚赖氨酸与葡聚糖(质量比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20)冻干粉置于RH 65%60℃反应12、24h。如图9,褐变程度随葡聚糖含量增大而下降。ε-聚赖氨酸与葡聚糖质量比1∶20时褐变最小。

如图9、图10,乳化性、乳化稳定性随着ε-聚赖氨酸与葡聚糖质量比增加呈现先增大后减小的趋势,ε-聚赖氨酸/葡聚糖质量比1∶15时乳化性最佳,ε-聚赖氨酸/葡聚糖质量比1∶10时乳液稳定性最佳。这可能由于当与ε-聚赖氨酸共价结合的葡聚糖分子较少时(ε-聚赖氨酸/葡聚糖质量比为1∶5)形成的蛋白质多糖共价复合物不能有效增加吸附层的厚度和强度,因而不能有效提高乳状液的稳定性。当结合在ε-聚赖氨酸分子上的葡聚糖分子过多时(ε-聚赖氨酸/

葡聚糖质量比1∶20),形成的复合物的亲水性过大,降低其乳化性[14]。因而形成具有理想乳化特性的ε-聚赖氨酸-葡聚糖共价复合物应具有足够的多糖结合蛋白质以提高复合物乳化性,同时应具有一定的疏水性,从而使复合物能快速且紧密地吸附在油水界面上保证乳化稳定性。

2.4.2 反应物质量比对ε-聚赖氨酸-葡聚糖复合物接枝度的影响 如图11,接枝度随ε-聚赖氨酸/葡聚糖质量比增大呈现先增加后减小的趋势,当质量比为15时,反应物之间反应基团的结合达到最佳状态,接枝度达到最大。这可能由于ε-聚赖氨酸分子量低,且自由氨基含量丰富;而葡聚糖分子量较大,引起空间位阻较大,且反应基团少。当葡聚糖含量较低时,大量的自由氨基处于非饱和状态而不能充分发生反应;当葡聚糖含量较多时,溶液粘度增大,由于大分子的空间稳定作用,使得活性位点不易靠近[19]。所以合适的反应物配比不但可以促使反应快速充分的进行,而且还可以降低副反应(焦糖化等)的发生。

图11 反应物质量比对接枝度的影响Fig.11 Effect of weight ratio of ε-polylysine to dextran on degree of graft

2.5 反应pH对ε-聚赖氨酸-葡聚糖复合物乳化性的影响

将ε-聚赖氨酸与葡聚糖(质量比1∶15)分别溶解于pH6.5、7.5、8.5、9.0的1/15mol/L磷酸缓冲液中,磁力搅拌1h后冷冻干燥,60℃,RH 65%反应24h。如图12,乳化性随pH的增大呈现先增大后减小的趋势,pH8.5时乳化性最佳。这可能因为美拉德反应本质上是一种碱催化反应,反应体系碱性越强,越有利于美拉德反应的发生。中性和偏酸性环境下,ε-聚赖氨酸的自由氨基易于质子化,不利于亲核反应的发生,但碱性过强可能导致蛋白质一级结构的破坏[5]。此外,ε-聚赖氨酸等电点pI为9.0[1],当溶液pHpI时,ε-聚赖氨酸显阴性,可增强蛋白质-蛋白质的静电排斥作用,或通过遮蔽正电基团间的相互作用减少蛋白-多糖的相互作用[20],可能导致乳化性下降。

图12 反应pH对乳化性的影响Fig.12 Effect of pH on emulsifying activity

3 结论

以乳化性改善为主要指标,褐变指数为次要指标,确定了ε-聚赖氨酸-葡聚糖美拉德干热反应最佳工艺条件:ε-聚赖氨酸/葡聚糖质量比1∶15,在pH8.5、相对湿度为65%、60℃条件下,反应24h后,得到的复合物乳化性较好且褐变程度较小。以乳化稳定性改善为指标,ε-聚赖氨酸/葡聚糖质量比1∶10最佳。通过接枝度变化证明产物结构变化生成共价复合物。

采用Turbiscan Lab Expert浓缩体系稳定性分析仪对乳液稳定性进行分析,通过Turbiscan图谱可以快速直观得出ε-聚赖氨酸--葡聚糖共价复合物制备乳状液的稳定性得到提高,为ε-聚赖氨酸-葡聚糖共价复合物在食品工业化中的应用提供理论基础。

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Study on emulsifying properties of ε-polylysine-dextran conjugates prepared from primary stage of Maillard reaction

YAN Bing,FANG Zi-shu,GAO Yan-xiang,YUAN Fang*(College of Food Science&Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China)

Emulsifying properties of protein can be improved through Maillard reaction.The conjugation of εpolylysine and dextran by dry heating was studied.Emulsifying property of ε-polylysine-dextran conjugates were compared at different reaction temperature,relative humidities,reaction time,weight ratio of dextran to ε-polylysine,pH by determining changes in emulsion turbidity,droplet size and turbiscan analysis.Browning index and degree of graft(DG)proved the conjugation of ε-Polylysine and dextran.It was found that the εpolylysine-dextran conjugates formed with ε-polylysine and dextran(1∶15 weight ratio)at 60℃,RH 65%for 1~3 days had better emulsifying activity and emulsifying stability than ε-polylysine and dextran alone.Conjugates prepared for 1d had better emulsifying activity,low browning index,and the DG was about 26.4%.Conjugates formed with ε-Polylysine and dextran(1∶10 weight ratio)for 1d had the best emulsifying stability.

ε-polylysine;dextran;Maillard reaction;emulsifying properties;browning index

TS201.2

A

1002-0306(2012)09-0053-06

2011-08-23 *通讯联系人

闫冰(1990-),女,本科生,研究方向:食品添加剂。

“国家大学生创新性实验计划”项目(091001923)。

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