柑橘皮中川陈皮素超声提取工艺及含量分析

徐旭耀，王汝娟，谢伟飞

（湛江师范学院化学科学与技术学院，广东湛江 524048)

柑橘皮中川陈皮素超声提取工艺及含量分析

徐旭耀，王汝娟，谢伟飞

（湛江师范学院化学科学与技术学院，广东湛江 524048)

以甲醇为提取溶剂，采用超声波提取柑橘皮中川陈皮素，并用高效液相色谱进行分析，结合单因素和正交实验对超声波提取柑橘皮中川陈皮素的提取工艺进行优化，探讨不同因素对柑橘皮中川陈皮素提取含量的影响。结果表明，最佳提取工艺条件为：90%甲醇、料液比1∶50（W/V）、提取温度50℃、提取时间60min。用优化后的提取条件进行加标回收实验，回收率为90.5%，并用于几样柑橘皮中川陈皮素含量测定。结果表明，精品橙皮中川陈皮素的含量最高。

川陈皮素，柑橘皮，超声提取，高效液相色谱（HPLC），检测

柑橘为芸香科植物，是世界上最重要的商品水果之一。柑橘果皮在医学上称陈皮，柑橘皮中除了含有丰富的芳香油、果胶、色素外，还含有橙皮苷、新橙皮苷、橘皮素、川陈皮素、二氢川陈皮等黄酮类化合物。黄酮类化合物是植物经光合作用产生的一大类植物的次生代谢产物，作为一种功能成分，其主要作用有抗肿瘤、延缓衰老、增强心血管功能、增强免疫力、调解内分泌系统、护肝、抗炎、抗过敏、抑菌、抗病毒等。根据近几年国内外对柑橘皮药理作用的广泛深入研究和临床实验，证实其中的黄酮类化合物起着非常重要的作用[1-3]。川陈皮素（nobiletin，NOB）又称蜜橘黄酮，结构见图1，是从柑橘果皮中提取的一种多甲氧基黄酮类化合物。目前国内外研究发现NOB具有广谱抗肿瘤、抗血栓、抗真菌、抗炎、抗动脉粥样硬化活性等作用[4-6]。近年来，大量研究显示NOB还具有神经营养活性[7]，可治疗阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease，AD）等神经衰退性疾病[8-11]。川陈皮素富含于柑橘类水果果皮中，但不同品种柑橘果皮中川陈皮素含量不同。本文旨在研究柑橘果皮中川陈皮素的超声提取工艺及含量测定，为柑橘果皮的综合开发利用提供实验依据。

图1 川陈皮素的分子结构Fig.1 Molecular structure of nobiletin

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

川陈皮素对照品，含量≥98% 天津一方科技有限公司；石油醚 分析纯；甲醇 色谱纯；蒸馏水；柑橘 市售。

Waters510高效液相色谱仪 包括Waters 510高压输液泵两台，柱温控制器（TCM），Waters 486紫外-可见光检测器（可调波长为190～600nm），Rheodyne77251手动进样器，486计算机millennium 2010色谱工作站，Gemini C18柱（150mm×4.6mm，5μm）；AE240双量程分析天平 梅特勒-托利多仪器上海有限公司；SB-3200型超声波清洗器 宁波新芝生物科技有限公司；微量移液管 热电仪器有限公司；迷你振荡器。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Gemini C18柱（150mm× 4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-水混合液；流速：1.0mL/min；柱温：室温；检测波长：328nm；进样体积：20μL。对照品和样品的色谱图见图2。

图2 对照品和样品的川陈皮素HPLC图Fig.2 HPLC chromatogram of nobiletin in standard and sample solutions

1.2.2 对照品溶液制备 精密称取川陈皮素1.93mg，加甲醇溶解，涡旋混合，定容于5mL容量瓶中，摇匀，即得386μg/mL川陈皮素对照品溶液，冷藏备用。

1.2.3 供试品溶液制备 将已烘干的新奇士柑橘皮用料理机破碎成粉末，经石油醚超声脱脂、脱色素，以排除干扰，挥尽石油醚，烘干粉末，置干燥器中备用。精密称取该粉末0.2g，加入一定浓度的提取溶剂，经超声波清洗器超声提取，过滤，定容，振荡均匀后经0.45μm微孔滤膜过滤得待测的供试品溶液。

2 结果与讨论

2.1 检测波长及流动相的选择

川陈皮素的紫外最大吸收波长为328nm[12]，以甲醇作为川陈皮素的流动相，当用100%甲醇做流动相时，峰的保留时间太短，经过反复实验，最终确定甲醇-水（59∶41）为流动相比例，保留时间适中，峰形比较好。

2.2 校准曲线的绘制

精确量取一定体积的川陈皮素对照品溶液，用甲醇稀释成一系列不同浓度的对照品溶液，按1.2.1的色谱条件进样测定，以浓度c（μg/mL）为横坐标，峰面积A为纵坐标，绘制校准曲线。结果表明，川陈皮素在1.93～145μg/mL范围内线性关系良好，校准曲线方程为：A=75144c-35902（r=0.9997）。

2.3 提取溶剂的选择

精密称取0.2g新奇士皮粉4份，分别以1∶40（g/mL）料液比的丙酮、无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯为溶剂超声处理30min，过滤，并用相应的溶剂定容，再用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液按1.2.1色谱条件进样测定。结果表明，甲醇超声提取较好。

2.4 提取条件的选择

采用单因素实验，以新奇士皮粉中川陈皮素提取含量为考察指标，平行称取几份样品，分别考察料液比、超声时间、超声温度、甲醇浓度四个因素对新奇士皮粉中川陈皮素提取含量的影响。根据单因素实验的结果，选取主要几个水平，采用正交实验设计，对川陈皮素的最佳超声提取工艺进行优化选择。

2.4.1 料液比的选择 精密称取样品0.2g各5份，用浓度100%甲醇在25℃超声45min，分别用1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）料液比的甲醇进行超声提取，过滤，定容，在1.2.1色谱条件下进样测定，结果见图3。由图3可知，料液比为1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）对川陈皮素提取效果较好。

图3 不同料液比对川陈皮素提取含量的影响Fig.3 Effect of the ratio of material to liquid on the extraction content of nobiletin

2.4.2 超声时间的选择 精密称取样品0.2g各5份，按料液比1∶40（g/mL）用100%甲醇溶解，在25℃超声30、45、60、75、90min，过滤，定容，在1.2.1色谱条件下进样测定，结果见图4。由图4可知，超声时间60、75、90min对川陈皮素提取效果较好。

图4 不同超声时间对川陈皮素提取含量的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction content of nobiletin

2.4.3 超声温度的选择 精密称取样品0.2g各4份，按料液比1∶40（g/mL）加入100%甲醇溶解，在30、40、50、60℃超声45min，过滤，定容，在上述色谱条件下进样测定，结果见图5。由图5可知，超声温度为40、 50、60℃对川陈皮素的提取效果较好。

图5 不同超声温度对川陈皮素提取含量的影响Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on the extraction content of nobiletin

2.4.4 溶剂甲醇浓度的选择 精密称取样品0.2g各5份，按料液比1∶40（g/mL），加入浓度为60%、70%、80%、90%、100%的甲醇，在25℃超声45min，过滤，定容，在上述色谱条件下进样测定，结果见图6。由图6可知，浓度为70%、80%、90%的甲醇对川陈皮素的提取效果较好。

图6 不同甲醇浓度对川陈皮素提取含量的影响Fig.6 Effect of methanol concentration on the extraction content of nobiletin

2.4.5 正交实验与结果分析 根据单因素实验的结果，选取每个影响因素的主要几个水平，采用L9（34）正交实验设计法，优化料液比、提取时间、提取温度、甲醇浓度四个因素，确定最佳提取工艺条件。正交设计因素水平见表1，实验方案和结果分析见表2，方差分析见表3。

表1 川陈皮素正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment of nobiletin

由表2可知，温度对川陈皮素提取含量影响最大，其次是料液比和时间，最后是甲醇浓度。从方差分析结果来看，温度对川陈皮素的提取含量影响非常显著，料液比对提取含量的影响显著。由极差和方差分析综合得出，超声提取新奇士皮粉中川陈皮素的最佳工艺条件是：A2B1C2D3，即料液比为1∶50（g/mL），超声时间为60min，超声温度为50℃，甲醇浓度为90%，这刚好和实验号4的结果吻合，这一结果已经出现在实验方案中，验证了A2B1C2D3是最优方案。

表2 川陈皮素正交实验方案与结果Table 2 Orthogonal experiment method and results of nobiletin

表3 柑橘皮中川陈皮素提取含量的方差分析表Table 3 Analysis of variance table of nobiletin extraction content in citrus peels

2.5 进样精密度实验

同一供试样品溶液，在1.2.1色谱条件下连续重复进样5次，每次20μL，测定川陈皮素吸收峰面积并计算得RSD为1.88%，表明仪器进样精密度良好。

2.6 重现性实验

精确称取同一批次样品0.2g各4份，按照最优的实验方案进行超声波处理，过滤，定容，在1.2.1色谱条件下进样，测定峰面积，并计算得到川陈皮素峰面积的RSD为1.70%，表明测定方法重现性良好。

2.7 加样回收实验

准确称取已知含量的样品0.2g共4份，分别加入川陈皮素对照品适量，按上述最优的实验方案制备供试品溶液，得到川陈皮素平均回收率为90.5%，RSD为1.98%。结果见表4。

表4 川陈皮素回收实验结果Table 4 The recovery experiment result of nobiletin

2.8 样品测定

按上述最优实验方案处理，测定5样柑橘皮样品，结果如表5。由表5可知，川陈皮素在5样柑橘果皮中的含量为：精品橙>蜜柑>巴西柑>胡柚>柠檬。

表5 几样柑橘皮中川陈皮素提取含量比较（以干重计）Table 5 Comparison among nobiletin content in several citrus peels

3 结论

本实验对超声提取柑橘皮中川陈皮素的工艺条件及含量进行研究。对超声提取中的料液比、时间、温度、甲醇浓度进行了单因素实验并采用L9（34）正交实验设计进行优化，以高效液相色谱对其含量进行检测分析。结果表明，超声提取柑橘皮中川陈皮素的最佳工艺条件为：料液比1∶50（g/mL），超声时间60min，提取温度50℃，甲醇浓度为90%，平均加标回收率为90.5%，相对标准偏差RSD为1.98%，说明方法稳定可靠，结果比较准确。在几种柑橘皮中精品橙的川陈皮素含量最高。

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Study on ultrasonic-assisted extraction of nobiletin from citrus peels and analysis of nobiletin content in several citrus samples

XU Xu-yao，WANG Ru-juan，XIE Wei-fei
（Chemistry Science and Technology School，Zhanjiang Normal University，Zhanjiang 524048，China）

With methanol as extraction solvent，the nobiletin from citrus peels which was extracted by ultrasonic assistance was determinated by HPLC，and the ultrasonic extracted process was optimized by single factor and orthogonal tests.The influences of different factors on the extraction content of nobiletin in citrus peels were studied.The results showed that the optimum extraction condition was：90%methanol，ratio of material to liquid 1∶50（W/V），extraction temperature 50℃，and extraction time 60min.The recovery was reached to 90.5%with the optimum condition which was used in the content determination of nobiletin from several citrus peels.The results showed that the nobiletin content in jingpin orange peels was higher than others.

nobiletin；citrus peel；ultrasonic extraction；high performance liquid chromatography（HPLC）；determination

TS201.2

B

1002-0306（2012）09-0301-04

2011－06－20

徐旭耀（1982-），男，硕士，实验师，研究方向：食品分析与检测。