黄芪多糖对B16-F10荷瘤鼠髓样抑制细胞免疫活性的影响

柴 旺，何小鹃，朱军璇，吕 诚，赵宏艳，吕爱平，喻长远△

(1.北京化工大学，北京 100029;2.中国中医科学院中医临床基础医学研究所，北京 100700;3.西南交通大学，成都 610031;4.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700)

中药材黄芪为豆科草本植物蒙古黄芪、膜荚黄芪的根，具有升阳固表、补中益气、托毒生肌、利水退肿之功效，黄芪多糖是黄芪中重要的有效活性成分［1］。目前研究结果表明，黄芪多糖能够有效提高机体的非特异性和特异性免疫功能，并可通过调节整体细胞免疫功能、诱导肿瘤细胞凋亡、调节具有杀伤肿瘤细胞的细胞因子等方面，对肿瘤细胞的生长产生抑制作用［2］。近年来，黄芪多糖抗肿瘤免疫机制的研究主要集中在激活和促进树突状细胞、巨噬细胞以及辅助性T细胞转化等方面，但对髓样抑制细胞(MDSC)调节和影响方面的研究较少［3］。为此，本实验拟以B16-F10荷瘤小鼠作为研究对象，通过观察黄芪多糖对荷瘤鼠髓样抑制细胞免疫活性的影响，探讨黄芪多糖在抗肿瘤免疫机制方面所发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级雄性 C57BL/6小鼠，体重 20g～22g，50只(中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，动物许可证 SCXK-(军)2007-004);黑色素瘤B16-F10细胞株(中国科学院上海生命科学研究院);RPMI1640培养基(美国 Gibcol公司);胎牛血清(美国 Gibcol公司);双抗(美国 Sigma公司);0.05%胰蛋白酶 +0.25%乙二胺四乙酸(0.05%trypsin+0.25%EDTA)(美国 Gibcol公司);磷酸盐缓冲液(PBS，北京中杉金桥生物技术有限公司);注射用环磷酰胺环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX，江苏恒瑞医药股份有限公司);黄芪多糖(Astragalus Polysaccharides，APS，天津赛诺制药有限公司);FITC anti-mouse Ly-6G/Ly6c(Gr-1)抗体(BioLegend公司);PE anti-mouse CD11b抗体(BioLegend公司);Mouse IL-10 platinum ELISA(eBioscience公司);Mouse VEGF-A platinum ELISA(eBioscience公司)。

1.2 方法

1.2.1 B16-F10 细胞培养 B16-F10(小鼠黑色素瘤)细胞株，消化液(0.05%trypsin+0.25%EDTA)消化后，传代培养。细胞培养环境:RPMI 1640完全培养基(RPMI 1640+10%FBS)，37℃5%二氧化碳培养箱。采用对数生长期的B16-F10细胞用于实验。

1.2.2 B16-F10荷瘤鼠模型的建立 将50只雄性C57BL/6小鼠随机分为正常组、模型组、环磷酰胺组(CTX)、黄芪多糖组、黄芪多糖 +CTX组5组。造模方法:将生长对数期的B16-F10细胞，调整细胞浓度为 4×106个/mL，以每只 0.1mL接种于C57BL/6小鼠右侧背部皮下。造模后第2天开始给药。正常组和模型组:生理盐水，0.2mL/只灌胃给药;CTX 组:10mg/kg，0.2mL/只腹腔注射给药，每天1次，连续给药7d;黄芪多糖组:150mg/kg，0.2mL/只灌胃给药，每天1次，连续给药14d;黄芪多糖 +CTX组:按150mg/kg黄芪多糖 每只0.2mL灌胃给药，每天1次，连续给药14d，同时按10mg/kg CTX，每只0.2mL腹腔注射给药，每天1次，连续给药7d。每3d称量各组小鼠肿瘤大小。第15天处死全部小鼠。采取眼球取血法，收集 C57BL/6小鼠血液，600g离心20min，收集血清，于-80℃低温冰箱保存;脱颈处死小鼠，取脾脏制备单细胞悬液，用于流式细胞术检测;取肿瘤，根据公式“抑瘤率 =(生理盐水对照组瘤体称重－药物组瘤体称重)÷生理盐水对照组瘤体称重×100%”，计算抑瘤率。

1.2.3 流式细胞术检测脾脏 Gr-1+CD11b+髓样抑制细胞比例 将脾脏剪碎用200目滤布过滤，1000r/min离心8min。将所得细胞加入2mL裂红液进行破红，1min后加入 PBS终止。选择1100r/min离心8min。调整细胞悬液浓度为1×107个/mL，取出100μL至EP管，用 PBS洗涤2次后，将细胞重悬于100μLPBS中，加入 FITC anti-mouse Ly-6G/Ly6c(Gr-1)抗体和PE anti-mouse CD11b抗体，避光4℃孵育30min。再用PBS洗涤细胞3次，最后将细胞重悬于500μLPBS中，上机检测 Gr-1+CD11b+髓样抑制细胞比例。

1.2.4 酶联免疫吸附试验检测血清 IL-10、VEGF含量 使用eBioscience公司的IL-10(白介素-10)、VEGF(血管内皮细胞生长因子)ELISA试剂盒检测小鼠血清中IL-10、VEGF含量。测定方法分别参照对应试剂盒上的说明进行。

1.3 统计学方法

采用SPSS10.0软件进行统计学分析，所有数据以珋x±s表示，组间比较采用t检验和单因素方差分析，P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 黄芪多糖对B16-F10荷瘤小鼠抑瘤率的影响

黄芪多糖和CTX均能显著抑制荷瘤鼠肿瘤生长。CTX、黄芪多糖、黄芪多糖+CTX组的抑瘤率分别为 68.73% 、75.2% 、79.78% 。

2.2 黄芪多糖对脾脏 Gr-1+CD11b+髓样抑制细胞的影响

表1显示，与正常组相比，模型组的脾脏Gr-1+CD11b+髓样抑制细胞比例显著升高(P＜0.01);与模型组相比，CTX、黄芪多糖、黄芪多糖+CTX治疗均可以显著降低脾脏Gr-1+CD11b+髓样抑制细胞比例(P＜0.01)。

表1 黄芪多糖对脾脏Gr-1+CD11b+髓样抑制细胞的影响

2.3 黄芪多糖对 B16-F10荷瘤鼠血清 IL-10、VEGF含量的影响

表2显示，与正常组相比，模型组的荷瘤鼠血清中分泌的IL-10和VEGF显著升高(P＜0.01);与模型组相比，CTX组、黄芪多糖组、黄芪多糖+CTX组的B16-F10荷瘤鼠血清中分泌的 IL-10、VEGF显著下降，有显著统计学差异(P＜0.01)。

表2 黄芪多糖对B16-F10荷瘤鼠血清IL-10、VEGF含量的影响

3 讨论

黄芪性温，味甘淡，有补气固表、利尿排毒、排脓、托疮生肌的功效［4］。黄芪多糖是黄芪中的主要活性成分，有提高机体免疫功能、抗病毒等作用［2］。近年来，黄芪多糖的抗肿瘤免疫机制得到了广泛研究［4］。研究表明，黄芪多糖可通过多种方式起到抗肿瘤的作用［3］。首先，黄芪多糖可通过激活巨噬细胞，刺激其释放 TNF-α、IFN-γ等细胞因子，发挥抗肿瘤作用［5］;其次，黄芪多糖可通过刺激 DC成熟，进而激活混合淋巴细胞反应和抗原特异性细胞毒性T(CTL)反应，发挥抗肿瘤作用［6］;再次，黄芪多糖可通过提高NK数量和活性、促进 Th细胞转化、使T细胞亚群恢复平衡的机制，起到抗肿瘤作用［7］。本实验结果显示，黄芪多糖可有效提高B16-F10荷瘤鼠的抑瘤率，抑制肿瘤生长，进一步印证了黄芪多糖的抗肿瘤免疫活性。

肿瘤免疫耐受机制是造成肿瘤疫苗没有较好疗效的原因之一，目前已经得到了人们广泛关注［8］。肿瘤组织中聚集着一群异质细胞，包括未成熟的树突状细胞、粒细胞、巨噬细胞等，其共同的表面标志为Gr-1+CD11b+，这群细胞被称为髓样抑制细胞(Myeloid de-rived suppressor cells，MDSC)，是引起肿瘤免疫逃逸的重要细胞群体［9］。IL-10是一种重要的免疫抑制因子，可通过对多种效应细胞和效应分子的抑制以及对肿瘤细胞的作用来抑制机体的抗肿瘤免疫，其作用包括抑制巨噬细胞功能、抑制 T淋巴细胞增殖和细胞因子合成等［10］。VEGF是由某些肿瘤细胞分泌而来，不但可诱导新生毛细血管生成，为实体肿瘤生长提供营养，而且可直接促进肿瘤生长，与实体肿瘤的生长和转移有密切关系［11］。MDSC可分泌 TGF-β、IL-10等抑制性细胞因子，诱导产生CD4+CD25+Fox p3+调节性 T细胞，抑制机体免疫［12］，此外，MDSC与 VEGF的分泌有密切关系，MDSC可聚集在血管周围，并促进VEGF分泌，进而促进实体肿瘤生长和转移［13］。近年来，对黄芪多糖的抗肿瘤免疫机制主要集中在巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞、Th细胞等方面［3］，而对髓样抑制细胞(MDSC)的影响报道甚少。本研究发现，黄芪多糖可抑制B16-F10荷瘤小鼠肿瘤生长，脾脏内Gr-1+CD11b+MDSC比例显著下降，同时显著抑制荷瘤鼠血清中 IL-10、VEGF释放。提示:黄芪多糖可能通过抑制MDSC产生及其相关细胞因子的分泌，从而减缓肿瘤所产生的免疫逃逸现象，同时抑制VEGF的分泌，阻断肿瘤营养供给，抑制肿瘤生长和转移。

综上，适当浓度的黄芪多糖可通过降低 MDSC的比例，抑制相关细胞因子 IL-10及VEGF的分泌来发挥抑制肿瘤生长的作用。

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