首乌延寿丹对去势后大鼠骨质疏松的防治作用

廖洪峰，王桂敏，李明慧，张 威，王志义，刘丹平

(1.辽宁医学院研究生院，辽宁 锦州 121001;2.辽宁医学院第一附属医院，辽宁 锦州 121001;3.锦州石化医院，辽宁 锦州 121001)

骨质疏松症(osteoporosis，OP)系由多种原因引起的一种骨病［1～3］，其特点是单位体积内骨量减少，骨皮质变薄，骨小梁大小及数目均减少，从而引起腰背和四肢疼痛，骨脆性增加，最终可导致骨折。目前各种治疗方法和治疗药物不断出现，主要有激素替代疗法(HRT)、降钙素类药物(CT)、甲状旁腺激素(PTH)、二磷酸盐类(BP)、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、氟化物、锶盐等［4～6］，这些药物或治疗方法在一定程度上都能缓解OP的病情，但也伴随着较大的副作用，如长期服用雌激素可以出现子宫内膜癌和乳腺癌，因而探索防治骨质疏松症的有效、安全的治疗方法和药物为我国的国家重点攻关课题之一。本文观察首乌延寿丹对大鼠去势后骨质疏松的防治作用和可能存在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物和饲料

健康SD雌性大鼠 60只，体重 200g～220g，由辽宁医学院动物实验中心提供。实验前置动物于室内适应环境1周，室温20℃ ～28℃。采用清洁级架式分笼饲养，标准饲料，饮用自来水。

1.2 药物

首乌延寿丹由辽宁医学院附属第一医院中药局提供，水煎制成，按照原方药物用量(何首乌50g，豨莶草、菟丝子各15g，杜仲、牛膝、旱莲草各10g等药组成)。尼尔雌醇由北京益民药业有限公司生产(批号0904100)。

1.3 仪器及试剂

QDR-4500A型双能X线骨密度仪购自美国HOLOGIC公司;550型酶标仪购自美国Bio-Rad公司;I型前胶原氨基末端前肽、I型胶原交联羧基末端肽、骨钙素、尿吡啶酚、尿肌酐试剂盒均产自sigma公司。

1.3.1 动物分组 健康 SD大鼠分笼饲养，室温20℃ ～22℃，相对湿度为50% ～60%，经适应性喂养1周后开始试验，遵循随机原则分成6组，每组10只，分别为假手术组、模型组、雌激素组、首乌延寿丹高、中、低剂量组。

1.3.2 动物造模 将6组大鼠采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3ml/100g体重)，除假手术组外，其余各组大鼠从腰背部脊柱两侧入路切除双侧卵巢。假手术组大鼠重复摘除卵巢步骤，但不摘除卵巢，仅在卵巢与输卵管连接处夹一下，术后给予青霉素肌肉注射，1万单位每只，连续5d抗感染。术后第2天开始大鼠阴道涂片观察，每天1次，连续5 d，以确定卵巢是否完全切除。除假手术组外，试验动物从术后的第5天起全部进入动情间期，证明去势彻底。而假手术组出现动情期，证明未去势。

1.3.3 给药方法和剂量 术后第5天开始给药，连续给药12周。假手术组和模型组每天予以生理盐水 1.79ml灌胃。雌激素组灌胃尼尔雌醇1.5mg/kg，每3d1次，其余2d时间灌等量生理盐水。低剂量组灌胃1.79ml中药(含3.04g生药)，中药中剂量组灌胃1.79ml中药(含6.08g生药)，中药高剂量组灌胃1.79ml中药(含9.12g生药)，均每天给药1次。

2 检测指标

2.1 骨密度测定

各组动物于末次给药后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，俯卧位置于QDR一4500A型双能X线骨密度仪及“The Small Subject Scan”软件测量分析股骨近端干髓端骨密度，扫描宽 15cm，扫描速度80mm/s，分辨率为310mm ×310mm。

2.2 血和尿生化指标测定

6周时将大鼠放到代谢笼，禁食、禁水1d，避光进行收集尿液，用消毒瓶装好;处死前进行颈动脉穿刺取血，用离心机处理3000r/min，共10min，－20℃度冰箱保存。取上层血清，全自动生化分析仪测定血清碱性磷酸酶(alkaline p h o s p h a t a se，ALP)、血钙(Ca2+)、血磷(P3+)。取血清，用 ELESA方法测量骨钙素(BGP)、I型前胶原氨基末端前肽(PINP)、I型胶原交联羧基末端肽(ICTP);取尿液，用ELESA方法测量尿吡啶酚(PYD)、尿肌酐(UCr);均用美国 Bio-Rad 550型酶标仪读取数值，具体操作按说明书进行。

3 统计学方法

数据采用计算机SPSS13.0统计分析软件处理，计量资料以均数±标准差表示，先确定样本是否符合正态分布，再行方差齐性检验，用单因素方差分析进行多重性组间差异性比较，P＜0.05差别有统计学意义。

4 结果

4.1 动物数量分析

最终进入统计分析的大鼠保持为6组，共计60只，无缺失值。

4.2 统计推断

4.2.1 各组大鼠骨密度测定 表1显示，与假手术组比较，模型组骨密度值显著性降低(P＜0.01)，说明骨质疏松大鼠模型制造成功。与模型组比较，中药各组和雌激素组骨密度值显著性升高(P ＜0.01)。

表1 各组大鼠BMD测量结果

4.2.2 各组大鼠 Ca2+、P3+、ALP 测量结果

表2 各组大鼠Ca2+，P3+，ALP测量结果

4.2.3 各组大鼠 PYD、U-Cr、PYD/U-Cr测量结果 表3显示，与模型组比较，假手术组、雌激素组和中药各组PYD、U-Cr、PYD/U-Cr均显著性降低(P＜0.01)。与雌激素组比较，中药各组PYD显著性升高(P＜0.01)。

表3 各组大鼠 PYD、U-Cr、PYD/Cr测量结果

4.2.4 各组大鼠 BGP、PINP、ICTP 测量结果表4显示，与模型组比较，假手术组、雌激素组和中药各组BGP、PINP、ICTP均显著性降低(P＜0.01)。与中药低剂量组比较，中药高剂量组 PINP值降低(P ＜0.05)。

表4 各组大鼠 BGP，PINP，ICTP测量结果

5 讨论

骨质疏松的建模方法如去势法、维甲酸诱导法、糖皮质激素诱导法等，其中去势法建模是美国食品与药品管理局(FDA)和世界卫生组织(WHO)推荐的研究骨质疏松症的最佳方法。本实验中各组动物的血清钙和血清磷水平差异均不显著，这说明体内雌激素水平的改变似乎不会直接影响血中的钙和磷含量。雌激素可与甲状旁腺素相拮抗，从而降低破骨细胞的作用，减慢骨质再吸收作用，骨质疏松组动物雌激素水平下降，溶骨过程加强，血中钙和磷含量似应上升。但是由雌激素水平下降所引起的破骨细胞活性增强，也能促使成骨细胞反应性地加强其功能活性，分泌更多的促进成骨作用的细胞因子，并加快骨组织的矿化速度，建立破骨细胞与成骨细胞的新平衡，由此使血中钙和磷含量不发生明显变化。血清中碱性磷酸酶50%来源于骨组织，另外部分碱性磷酸酶来自于肝脏肝细胞分泌，由于碱性磷酸酶是同工酶，因此它对骨组织而言缺乏特异性和敏感性［7］。本实验中各组动物血清钙、血清磷、碱性磷酸酶在各组均无明显改变，说明单纯应用血清钙、血清磷、碱性磷酸酶等经典骨代谢生化指标检测骨转化状况，存在特异性低和敏感性低的缺点。

PYD是骨内I型胶原的重要组成成分，当骨溶解时，骨胶原分子蛋白水解，则PYD即以游离状态进入血液并以原形直接从肾脏排出，因此尿中的PYD含量能够反映出骨吸收的程度。本实验雌激素组和中药各组明显减少PYD的排出量，较模型组PYD/U-Cr明显减低，明显减少I型胶原的分解，因而降低骨吸收。

BGP又称 γ-羧基谷氨酸蛋白(Bone G l a Protein)，是成骨细胞合成和分泌的一种激素样多肽，是反映骨更新状态和骨形成的一种特异性指标。血清骨钙素水平是反映成骨细胞活性、骨转换和骨形成的特异指标［8］。骨形成或骨转换增加均可使血清BGP增加。补充首乌延寿丹和尼尔雌醇后BGP水平降低，说明首乌延寿丹和尼尔雌醇能抑制去势大鼠骨转换，使去势大鼠成骨细胞活性降低。

Ⅰ型胶原存在于骨、肌腱和皮肤中是骨组织中惟一的胶原，占骨基质的90%。I型胶原衍生自一个较大的蛋白，即 I型前胶原，PINP即 I型前胶原氨基末端前肽，是I型前胶原细胞外分解产物，其血液中的含量主要反映I型胶原的合成速率和骨转换的情况，升高提示I型胶原合成速率加快，骨转换活跃。目前认为，PINP是新骨形成的特异性敏感指标［9］。ICTP是Ⅰ型胶原蛋白降解过程中的另一个特异性产物，只来源于破坏的成熟骨基质，不再进一步分解，按胶原降解比例1/1释放入血。血清ICTP的变化与骨形态计量学骨吸收参数呈显著正相关，并与骨吸收生化指标尿砒啶酚和脱氧吡啶酚呈正相关［10］。因此，血清 ICTP水平是破骨细胞性胶原降解的灵敏指标。

本实验去势后大鼠补充首乌延寿丹和雌激素后，较模型组 BGP、PINP、ICTP值均明显减低，说明首乌延寿丹和雌激素能抑制去势大鼠骨转换，使大鼠成骨细胞活性减低，破骨细胞功能受到抑制。

中医学认为，肾“主骨生髓”，骨的生长、发育、修复都有赖于肾之精气的滋养和推动。随着年龄增高，肾气渐衰，筋骨懈惰，临床可见腰背酸痛、骨痛、关节疼痛等症状，故其病因病机可归纳为肾虚、脾虚，其中以肾虚为主，属中医“骨痹”、“骨痿”范畴。本方中何首乌、菟丝子、杜仲、旱莲草、黑芝麻、女贞子、金樱子补肾益精，牛膝、莶草等活血通脉，诸药合用共奏补肾活血之功，是延缓衰老之名方。

雌激素替代疗法防治绝经后骨质疏松已经得到公认，这种疗法既降低骨吸收又抑制骨形成，使雌激素缺乏所诱导的过度骨转换水平下降，以增加骨量［11］。本实验结果也证实了这一观点。本研究结果表明，首乌延寿丹对去卵巢骨质疏松大鼠的防治作用与降低骨转换有关，同时首乌延寿丹对骨转换状态的抑制作用较雌激素小，推测应用更长时间，首乌延寿丹的防治效果可能优于雌激素。首乌延寿丹防治骨质疏松的具体机制有待于进一步研究。

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