通脉胶囊微生物限度检查方法的验证

天津医科大学总医院（300052）李彬

通脉胶囊是由丹参、赤芍、草决明、郁金、莪术、王不留行等8味中药组成的中药制剂，具有活血行气，安神宁心的功效。根据《中国药典》2010年版的规定，药品在进行微生物限度检查前必须对其检查方法进行验证，以确认该供试品所采用的检查方法无抑菌作用后在进行检查，才能真实反映该药品受污染的程度[1]。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LIBRORAEG120电子天平（川本岛津）；YJA电动匀浆仪（台州市椒江五星机械仪器有限公司）；MJX-1501培养箱（广东省医疗器械厂）。

1.2 试药与培养基 营养琼脂培养基（批号080919），玫瑰红钠琼脂培养基（批号080606），胆盐乳糖培养基（批号080528），营养肉汤培养基（批号070111），pH7.0的无菌氢氧化钠-蛋白胨缓冲液（批号070413），改良马丁培养基（批号080408），均为中国药品生物制品检定所提供；通脉胶囊（批号20110605）。

1.3 菌种 大肠埃希菌[CMCC(B)44102]，金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]，枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]；白色念珠菌[CMCC(F)98001]；黑曲霉[CMCC(F)98003]，均由中国药品生物制品检定所提供。

2 方法与结果

2.1 菌液制备 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物接种至营养肉汤培养基中，于30℃～35℃培养18～24小时；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，25℃培养18小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含菌数约为50～100cfu的菌悬液。取黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5～7天后加入4mL 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱后，用管口带有薄的无菌棉花吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1mL含孢子数约为50～100cfu的孢子悬液。

2.2 供试液的制备 取本品10g，加pH7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，用匀浆仪，混匀，作为1:10的供试液。

2.3 方法验证

2.3.1 细菌、霉菌和酵母菌计数的验证

2.3.1.1 细菌计数的验证

2.3.1.1.1 试验组 ①常规法：取2.2项下制备的供试液1mL和1mL试验菌（约50～100cfu）分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝。每株试验菌平行制备2个平皿。在30℃～35℃培养箱中培养48小时，点计菌落数，取均值。②培养基稀释法：取2.2项下制备的供试液2mL，每1mL等量分注5个平皿，即每皿0.2mL，每皿中加入1mL试验菌（约50～100cfu），立即倾注琼脂培养基，待凝。培养时间与常规法相同。

2.3.1.1.2 菌液组 取1mL试验菌（约50～100cfu），分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，按平皿法测定所加的试验菌数（分别为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌）。

2.3.1.1.3 供试品 对照组按试验组的方法，不加菌悬液，按菌落计数方法测定供试品菌数（本底菌）。

2.3.1.1.4 稀释剂 对照组取与供试液等量的稀释剂和菌悬液1mL注入1个平皿中，培养基注皿，培养，计数。

2.3.1.2 霉菌和酵母菌计数的验证

2.3.1.2.1 试验组 ①常规法：取2.2项下制备的供试液1mL和1mL试验菌（约50～100cfu）分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝。每株试验菌平行制备2个平皿。在23℃～28℃培养箱中培养72小时，点计菌落数，取均值。②培养基稀释法：取2.2项下制备的供试液2mL，每1mL等量分注5个平皿，即每皿0.2mL，每皿中加入1mL试验菌（约50～100cfu），立即倾注琼脂培养基，待凝。培养时间与常规法相同。

2.3.1.2.2 菌液组 取1mL试验菌（约50～100cfu），分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，按平皿法测定所加的试验菌数（分别为白色念珠菌和黑曲霉菌）。2.3.1.2.3 供试品 对照组按试验组的方法，不加菌悬液，按菌落计数方法测定供试品菌数（本底菌）。

2.3.1.2.4 稀释剂 对照组取与供试液等量的稀释剂和菌悬液1mL注入1个平皿中，培养基注皿，培养，计数。试验组菌回收率=（试验组菌落数-供试品对照组菌落数）/试验组菌落数×100%；稀释剂对照组回收率=稀释剂对照组菌落数/试验组菌落数×100%。《中国药典》规定对各试验菌株的回收率均不得低于70%。用常规法测定该品种对5个试验菌株的回收率，以确定其抑菌程度（见附表1）。

由附表1可知，本品对大肠埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉无抑菌作用，而对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有一定的抑菌作用。采用培养剂稀释法测定各试验菌株的回收率（见附表2）。

由附表2可知，采用培养剂稀释法可有效消除药品对各试验菌株的抑菌作用。

2.3.2 控制菌检查法的验证 （见附表3）

2.3.2.1 大肠埃希菌检查法的验证

2.3.2.1.1 试验组 取10mL 2.2项下制备的供试液和1mL大肠埃希菌（约50～100cfu）加入100mL的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时。

2.3.2.1.2 阴性菌对照组 取10mL 2.2项下制备的供试液和1mL金黄色葡萄球菌（约50～100cfu）加入100mL的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时。

2.3.2.1.3 阳性对照组 取1mL 大肠埃希菌（约50～100mL）加入100mL的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时。取试验组、阴性菌对照组和阳性对照组上述培养物各0.2mL，分别接种至含5mL MUG培养基的试管内培养，于5、24小时在366nm紫外光下观察，试验组管MUG阳性，靛基质阳性；阴性菌对照组MUG阴性，靛基质阴性；阳性对照组管MUG阳性，靛基质阳性。

2.3.2.1.4 试验结果 阳性对照组检出大肠埃希菌；阴性菌对照组未检出大肠埃希菌；试验组检出大肠埃希菌。验证结果符合要求。

附表1 常规法测定各试验菌株的回收率（%）

附表2 培养剂稀释法测定各试验菌株的回收率（%）

附表3 控制菌验证结果

2.3.2.2 大肠菌群检查法的验证

2.3.2.2.1 试验组 取1mL 2.2项下制备的供试液和1mL大肠埃希菌（约50～100cfu）加入到10mL的胆盐乳糖发酵培养基中，培养18～24小时。

2.3.2.2.2 阴性菌对照组 取1mL 2.2项下制备的供试液和1mL金黄色葡萄球菌（约50～100cfu）加入到10mL的胆盐乳糖发酵培养基中，培养18～24小时。

2.3.2.2.3 阳性对照菌 取1mL 2.2项下制备的供试液和1 m L大肠埃希菌（约50～100cfu）加入到10mL的胆盐乳糖发酵培养基中，培养18～24小时。试验组管和阳性对照组管均有菌生长且产酸产气，阴性菌对照组无菌生长且不产酸产气。结果：试验组检出大肠菌群；阴性菌未检出大肠菌群；阳性对照组检出大肠菌群。

2.3.2.3 供试品控制菌检查 取10mL 2.2项下制备的供试液置100mL的胆盐乳糖培养基中，依法检查，结果显示，样品每1g中未检出大肠埃希菌。

2.4 结果 试验结果显示，细菌计数采用培养剂稀释法；霉菌和酵母菌计数采用平皿法；控制菌采用常规法。

3 讨论

中药制剂的微生物限度检查通常是按常规的药品卫生学检验方法进行细菌、霉菌和酵母菌计数的。由于中成药是含有多种成分的复方制剂，其中任何具有抑菌作用的成分均可影响微生物限度检查的准确性[2]。因此，本试验以5种阳性对照菌的回收率作为评价指标，确定了通脉胶囊的微生物限度检查方法。该方法可用于通脉胶囊微生物的质量控制。