局限性硬皮病患者血清中可溶性白介素-2受体、肿瘤坏死因子-α及T 淋巴细胞的表达

苏有明，李海涛，祝 贺，任冬梅，宋克敏，杨蓉娅

局限性硬皮病的病因至今尚未完全明了，有研究认为与机体免疫功能相关[1-4]。为探讨炎症免疫相关细胞因子在限局性硬皮病中的意义，我们对39例局限性硬皮病患者外周血T淋巴细胞及血清可溶性白介素2α受体（sIL-2R）和肿瘤坏死因子（TNF）-α进行检测，以探讨其在发病中的作用。

1 资料和方法

1.1 研究资料

39例局限性硬皮病患者为我院皮肤科门诊及住院患者，均符合局限性硬皮病诊断标准，并经组织病理检查确诊。其中斑块状硬皮病16例，点滴状硬皮病7例，线状或带状硬皮病13例，泛发性硬皮病3例。男27例，女12例，年龄6～45岁。依据临床表现分为活动期21例、非活动期18例（活动期硬皮病：皮损逐渐扩大，反复出现新皮损，有紫红色斑，逐渐变硬，表面光滑发亮，毛细血管扩张；非活动期硬皮病：病程＞1年，没有新皮损出现，旧皮损大小无改变，皮损变软呈棕色）。对照组为39名健康献血者，男24例，女15例，年龄26～48岁。所有入组者检测前均未使用过糖皮质激素和免疫调节剂。限局性硬皮病组和对照组均无菌抽取静脉血2 ml，分别合并并分离血清，于-30℃储存备用。同时实验当场分别取两组入组者静脉血4 ml。

1.2 器材与试剂

DMEM培 养 基（美 国 SER-VA）、PHA（美 国Sigma公司）、淋巴细胞分液Ficoli（上海试剂厂）；T细胞亚群、TNF-α测定试剂盒（军事医学科学院）；血清sIL-2R测定药盒（吉林大学医学部）。

1.3 实验方法

1.3.1 T淋巴细胞增殖测定 对照组和局限性硬皮病患者静脉血4 ml，经肝素抗凝，加入1∶50、1∶250、1∶1 250、1∶2 500、1∶5 000 倍量淋巴细胞分离液，离心，获取外周血淋巴细胞（PBMC），经Hanks液洗涤3次，用DMEM培养基将PBMC浓度调整为5×1012个/L的细胞悬液。将24孔细胞培养板每孔加入PBMC 0.1 ml、DMEM 1 ml、PHA 50 μg、硬皮病患者血清0.1 ml；上述培养体系中将硬皮病患者血清改为对照1组血清0.1 ml，重复上述步骤操作 ；空白对照以DMEM补充至容量。置于5.0%二氧化碳培养箱、37℃培养72 h。离心涂片，瑞氏染色，镜检200个细胞，按下列公式计算淋巴细胞增殖率 ：淋巴增殖率（%）=（患者血清增殖率-患者血清自然增殖率）/（非患者血清增殖率-患者血清自然增殖率）×100%

1.3.2 血清sIL-2R、TGF-α的测定 采用单克隆与多克隆双抗体夹心法，按试剂盒说明书操作。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 局限性硬皮病患者血清对淋巴细胞增殖的影响

无论是局限性硬皮病组或健康对照组的PBMC，加入局限性硬皮病患者血清标本后，淋巴细胞增殖率明显低于加入正常对照组血清的标本和空白对照组，组间和组内比较差异有统计学意义（P＜0.01）（表1）。

表1 不同来源血清对淋巴细胞增殖率的影响 （±SD，%）

表1 不同来源血清对淋巴细胞增殖率的影响 （±SD，%）

淋巴细胞来源例数空白对照正常对照血清患者血清患者组 39 41.37±4.89 37.15±2.58 26.56±3.83对照组 39 68.27±3.36 66.89±3.84 42.38±4.44

表2 不同稀释度患者血清对淋巴细胞增殖率的影响 （±SD，%）

表2 不同稀释度患者血清对淋巴细胞增殖率的影响 （±SD，%）

细胞来源 例数 1∶50 1∶250 1∶1 250 1∶2 500 1∶5 000 未加血清患者组 39 25.61±2.44 29.01±2.33 30.84±3.32 34.07±3.91 37.91±2.25 42.93±4.68对照组 39 35.50±4.05 39.80±4.50 40.09±8.64 48.36±2.65 55.78±4.88 68.24±3.89

2.2 不同稀释度局限性硬皮病患者血清对淋巴细胞增殖的影响

不同稀释度的局限性硬皮病患者血清对局限性硬皮病患者和对照组的淋巴细胞增殖均有抑制作用（P＜0.05）（表2），且呈剂量依赖关系，浓度越高，抑制效应越强。

2.3 局限性硬皮病患者血清sIL-2R、TNF-α的变化

39例局限性硬皮病患者血清sIL-2R、TNF-α水平明显高于对照组，两组间差异有统计学意义（P＜0.01），其中局限性硬皮病活动期患者的sIL-2R水平明显高于正常对照组和非活动期的患者（P＜0.01）。

表3 局限性硬皮病患者与对照组TNF-α、sIL-2R水平比较 （ ±SD）

表3 局限性硬皮病患者与对照组TNF-α、sIL-2R水平比较 （ ±SD）

注：与对照组比较，*P＜0.01；与非活动期比较，**P＜0.05

组别 例数 sIL-2R TNF-α(U/ml)限局性硬皮病 39 532.4±175.8 2.082 0±0.157 6*活动期 21 675.1±230.1**非活动期 18 380.5±134.3对照组 39 188.6±45.2 1.108 2±0.025 3

3 讨论

局限性硬皮病患者血清中出现的免疫抑制因子是导致机体免疫功能紊乱及受抑制的主要原因，免疫抑制因子是一类调节免疫反应的重要细胞因子，主要来源于T淋巴细胞、巨噬细胞[5]，其中CD4(辅助性T细胞)和CD8(抑制T细胞)对机体的细胞免疫和体液免疫发挥重要的调节作用。本研究结果显示血清中sIL-2R、TNF-α含量较对照组高，提示本病与免疫功能紊乱有关。

局限性硬皮病患者血清对正常人淋巴细胞PHA诱导的增殖活性有显著抑制作用，此抑制活性呈明显剂量依赖关系，即使血清稀释至1∶5 000倍仍具抑制效应，而未加患者血清的淋巴细胞增殖率，则不具有上述规律。由于本实验采用局限性硬皮病患者混合血清，可以稀释为局限性硬皮病淋巴细胞在体外脱离了血清后淋巴细胞增殖率有一定恢复，而加入局限性硬皮病患者血清后，对局限性硬皮病患者淋巴细胞的抑制作用重新表现出来。由此表明局限性硬皮病患者血清中的相关因子在机体免疫抑制中起着重要作用。

sIL-2R是一种T淋巴细胞的激活标志[4,5]，也可反映某一组织或体液免疫活性状态。sIL-2R增高一方面可能竞争性的抑制IL-2使之清除加速，从而抑制T淋巴细胞的增殖反应。同时高水平的sIL-2R还可影响B淋巴细胞功能和体液免疫水平，参与免疫损伤的发生，激活并促进细胞C-myc、C-fos基因表达，使细胞增殖，加重局限性硬皮病的过程。TNF-α是参与机体损伤时的重要递质，由巨噬细胞、T淋巴细胞等多种细胞产生[6,7]，除参与免疫和炎症反应外，同时能够抑制IL-2依赖性的CD4和CD8 T淋巴细胞的分化。因此，免疫活性细胞、细胞因子和调节基因的相互作用构成了体内细胞生长和分化的复杂免疫网络系统。血清sIL-2R、TNF-α水平升高和T淋巴细胞亚群异常导致了机体免疫功能紊乱，可能是局限性硬皮病的发病诱因之一[8-10]。细胞因子共同作用于局限性硬皮病皮损中，刺激其增殖、增强其活性，使其合成并分泌大量的胶原和纤连蛋白，引起ECM的合成和沉积增加，参与局限性硬皮病纤维化形成过程。

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