Src酪氨酸激酶抑制剂对人胃癌细胞SGC7901上皮-间质转变相关基因的作用及机制

林 伟，陈金坤，邱仙土，陈建新

（福建省莆田学院附属医院普通外科，莆田351100）

近年来，肿瘤上皮间质转变（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和肿瘤浸润及转移的关系备受关注。EMT是指上皮细胞与周围间质细胞相互作用，E-钙黏素(E-cadherin)等细胞粘附分子表达减少，细胞间连接解体，细胞分散，角蛋白为主的细胞骨架逐渐转变为波形蛋白为主的细胞骨架，导致细胞骨架重排，纤粘连蛋白表达增加，细胞粘附能力下降、运动能力增强，逐渐丧失上皮细胞极性获得间质细胞特性的过程[1]。EMT可使没有侵袭的肿瘤细胞获得浸润能力，促进肿瘤形成局部浸润和远端转移。胃癌是最常见的消化系统肿瘤之一，早期发现率低，确诊时多数已出现了肿瘤转移，因此抑制肿瘤转移是治疗胃癌的关键。Src酪氨酸激酶已经被证明与肿瘤转移密切相关，本文旨在探讨Src酪氨酸激酶抑制剂对人胃癌细胞SGC7901上皮间质转变的抑制作用及机制，为临床应用Src酪氨酸激酶抑制剂治疗胃癌转移提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 人胃癌细胞SGC7901购于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，Src酪氨酸激酶抑制剂4-苯胺喹唑啉购自AstraZeneca公司，化学发光HRP底物购自Millipore公司，real-time PCR系统购自ABI公司，双荧光报告基因检测系统购自Promega公司。

1.2 细胞培养 SGC7901细胞于5%CO2、37℃、饱和湿度条件下，以RPMI1640培养液（含10%小牛血清）中培养及0.25%胰酶-EDTA消化，采用对数生长期细胞进行实验。

1.3 4-苯胺喹唑啉对细胞生长的抑制作用 细胞2×104/mL接种于96孔板，每孔0.1mL，温育24 h后，分别加入不同浓度的4-苯胺喹唑啉，分别设置细胞对照及空白对照，每组样本设5个复孔，温育48 h后，加入MTS，培养2 h后测定吸光度值（490 nm）。

1.4 4-苯胺喹唑啉对p-Src、E-cadherin及β-连环蛋白（β-catenin）表达的影响 将细胞接种于直径10 cm培养皿上，待细胞长满培养皿的90%时，给予不同浓度的Src酪氨酸激酶抑制剂4-苯胺喹唑啉（5和10μmol/L）37℃下温育6 h，用预冷的PBS漂洗2次，立即加入300μL细胞裂解液，4℃下14 000×g离心5min，取上清液，用Bradford蛋白分析试剂测量所提取蛋白的浓度。

取100μg蛋白样品行SDS-PAGE分离蛋白,随后电转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭非特异性抗原1 h，加入兔抗人Src酪氨酸磷酸化特异性多克隆抗体1∶500稀释（Millipore），鼠抗人E-cadherin 单克隆抗体 1∶500 稀释（Santa Cruz），鼠抗人 β-catenin单克隆抗体 1∶500稀释（Santa Cruz），1∶200稀释的鼠抗人 β-actin单克隆抗体（Sigma）作为内对照，4℃反应过夜，用含0.1%Tween 20的TBS洗膜，加入1∶1 000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下反应1 h，洗膜后DAB显色，将条带结果进行扫描。

1.5 4-苯胺喹唑啉对E-cadherin及 β-catenin mRNA表达的影响 将细胞3×105/mL接种于6孔板，用不同浓度的Src酪氨酸激酶抑制剂4-苯胺喹唑啉（5和10μmol/L）37℃下温育6 h，收集细胞后用TRIzol抽提总RNA，并将GAPDH作为内参照，用以下引物序列扩增：E-cadherin上游引物序列：5′-GTCACTGACACCAACGATAATCCT-3′，下游引物序列：5′-TTTCAGTGTGGTGATTACGACGTTA-3′；β-catenin 上游引物序列：5′-GCTCTTCGTCATCTGACCAGCC-3′，下游引物序列：5′-GAGCAAGTTC ACAGAGGACCC-3′；GAPDH 上游引物序列：5′-CCACCCATGGCAAATTCC-3′；下游引物序列：5′-GATGGGATTTCCATTGATGACA-3′。扩增条件为：预变性94℃，5min，共进行35个循环扩增，每一循环包括 95 ℃ 5 s、65 ℃ 35 s。

1.6 4-苯胺喹唑啉对Snail启动子活性的影响 将SGC7901细胞3×105/mL接种于6孔板，用不同浓度4-苯胺喹唑啉（5、10μmol/L）温育 6 h，应用 LipofectamineTM2000转染pSnail-luc和CMV启动子海肾

荧光酶内标报告基因载体24 h后，用双荧光酶测定试剂盒检测Snail的转录活性，计算萤火虫荧光酶激发光子数目和海肾荧光酶激发光子数目的比值。Snail启动子序列为：Sense ：5′-CCAGATCTCAAAGCACACTTCCCTTTGCATTG-3′； Antisense：5′-GGGCCATGGTGGTCGAGGCACTGGGGTC-3′。

1.7 统计学处理 数据采用SPSS 11.0统计分析软件进行方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4-苯胺喹唑啉对SGC7901细胞生长的抑制作用 4-苯胺喹唑啉在10μmol/L时对SGC7901细胞无明显毒性，超过此浓度后，4-苯胺喹唑啉对SGC7901细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性，因此选择5μmol/L及10μmol/L 4-苯胺喹唑啉进行研究。

2.2 4-苯胺喹唑啉对SGC7901细胞Src酪氨酸激酶磷酸化的抑制 如图1所示，4-苯胺喹唑啉可显著抑制SGC7901细胞中Src蛋白的自主磷酸化（p-Src），且呈现剂量依赖性。

2.3 4-苯胺喹唑啉对SGC7901细胞中E-cadherin及β-catenin表达的影响 如图2所示，4-苯胺喹唑啉可增加SGC7901细胞E-cadherin在mRNA及蛋白水平表达，抑制β-catenin在mRNA及蛋白水平表达，且呈现剂量依赖性。当4-苯胺喹唑啉浓度为5和10μmol/L时，SGC7901细胞中E-cadherin的 mRNA表达是对照组的 161.2%（P<0.05）和298.1%（P<0.05），β-catenin的 mRNA 表达是对照组的 63.9%（P<0.05）和 19.6%（P<0.05）（表 1）。

表1 4-苯胺喹唑啉对SGC7901细胞中E-cadherin和β-catenin mRNA表达的影响Tab 1 Effectof 4-anilinoquirazolineon E-cadherin andβ-catenin mRNA expression in SGC7901 cells

2.4 4-苯胺喹唑啉对SGC7901细胞Snail启动子活性的抑制 如图3所示，4-苯胺喹唑啉可降低SGC7901细胞Snail启动子活性，且呈现剂量依赖性。4-苯胺喹唑啉浓度为5和10μmol/L时，Snail启动子活性是对照组的62.3%（P<0.05）和18.3%（P<0.05）。

3 讨论

EMT是胚胎发育过程中所必需的生理机制，随着EMT的研究不断深入，其在肿瘤转移中的作用不断被发现，成为EMT研究的热点。肿瘤细胞在EMT过程中发生结构改变，E-cadherin逐渐丧失，波形蛋白、纤连接蛋白表达增加，导致肿瘤细胞极性丧失，与周围组织、细胞接触减少，迁移能力增强。研究发现，Src酪氨酸激酶在胃癌在内的多种恶性肿瘤中均发生异常活化，引起肿瘤细胞生长、增殖和黏附的异常，导致肿瘤转移侵袭能力增强[2-3]。本研究证明，Src酪氨酸激酶抑制剂4-苯胺喹唑啉可抑制在SGC7901细胞中Src酪氨酸激酶磷酸化并呈剂量依赖关系，我们以此考察4-苯胺喹唑啉抑制人胃癌细胞EMT的作用及机制。

E-cadherin是重要的粘附分子，也是EMT的重要标志物，对维持上皮表型、稳定细胞间接触有重要意义。E-cadherin蛋白随着肿瘤恶性程度上升而下降，在正常组织中呈强表达，在肿瘤组织中呈低表达，甚至不表达。E-cadherin水平的下降可以导致肿瘤细胞黏附力降低，导致肿瘤细胞侵袭性增加[4]。本研究发现4-苯胺喹唑啉抑制Src酪氨酸激酶活性后，可显著地增加胃癌细胞中E-cadherin的mRNA与蛋白表达，表明4-苯胺喹唑啉抑制EMT过程可能与其增加肿瘤细胞中E-cadherin表达有关。

β-catenin作为细胞黏附分子和信号传导分子在维持细胞的结构和功能方面发挥重要的作用，可作为细胞骨架成份参与细胞黏附，并在细胞核内参与基因转录。β-catenin是经典的E-cadherincatenin复合体的重要成员，可与E-cadherin结合参与细胞黏附，参与细胞间的连接。β-catenin也是Wnt信号通路中调控转录活性的关键蛋白，可进入细胞核与核内转录因子TCF/LEF形成复合体，进而激活 c-myc、cyclinD1、MMPs等一系列 Wnt信号靶基因的转录，其异常表达对肿瘤的增殖和侵袭转移有重要作用，促进上皮-间充质转变[5]。本研究中4-苯胺喹唑啉可显著地抑制胃癌细胞中β-catenin的mRNA与蛋白表达，表明4-苯胺喹唑啉对EMT的抑制作用可能与其抑制肿瘤细胞β-catenin表达有关，其机制可能与稳定的E-cadherin-catenin复合体，抑制 c-myc、cyclinD1、MMPs等促癌基因活化，从而抑制上皮-间充质转变相关基因的表达。

近年来，许多研究证实Snail等多种转录因子在肿瘤转移中起重要作用，可通过抑制E-cadherin的表达来促进EMT的发生。Snail属于锌指蛋白，可通过与Smad相互作用竞争性结合E-cadherin启动子区的E-box序列，抑制E-cadherin表达，上调βcatenin表达，诱导EMT的发生[6]。Snail启动子活性的降低可下调Snail表达，进而降低对E-cadherin表达的抑制作用。本研究中4-苯胺喹唑啉可显著地抑制胃癌细胞中Snail转录活性，表明4-苯胺喹唑啉对EMT的抑制作用可能与其抑制肿瘤细胞Snail启动子活性有关。

综上所述，Src酪氨酸激酶的活性与胃癌EMT密切相关，其机制可能为Src酪氨酸激酶可调节Snail转录活性，进而调节E-cadherin及β-catenin表达有关。本研究表明，Src酪氨酸激酶抑制剂4-苯胺喹唑啉可显著抑制EMT的发生发展，为临床胃癌治疗提供了理论依据。

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