委陵菜黄酮衍生物促进L6细胞GLUT4的转位活性

刘 佳，秦 楠，牛文彦，段宏泉

（1.天津医科大学药学院，基础医学研究中心，天津300070；2.天津医科大学免疫学教研室，天津300070）

目前世界上糖尿病患病人数已高达2亿5千万人，每年新发病6百万人，其中90%以上是2型糖尿病(T2DM)。2型糖尿病是由于胰岛素分泌减少，胰岛素作用缺陷以及靶组织（主要是肌肉和肝脏）的胰岛素抵抗引起的。骨骼肌摄取葡萄糖主要由跨膜蛋白葡萄糖转运子4（glucosetransporter4-GLUT4）完成，骨骼肌细胞膜上的GLUT4的数量决定葡萄糖摄取量[1-2]。本课题组通过对抗糖尿病活性成分委陵菜黄酮进行结构修饰得到了一系列黄酮类衍生物，报道了该类黄酮衍生物能够显著提高胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖消耗量[3-4]。本文旨在评价黄酮衍生物对不同的糖尿病相关靶组织的作用，选择了大鼠骨骼肌细胞（L6）并通过类ELISA法测定L6细胞膜上GLUT4的量，以评价黄酮衍生物对骨骼肌葡萄糖利用的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 L6GLUT4myc细胞株由加拿大Amira Klip教授惠赠；α-MEM（天润善达公司）；胰酶（天润善达公司），D-Hanks液配制；Hanks液（天润善达公司）；胎牛血清（以色列STERILE）；抗myc单克隆抗体（9E10，Sigma公司）；偶联HRP的山羊抗兔抗体（Jackson Immuno Research）；胰岛素（Sigma公司）。

1.1.2 黄酮衍生物1~14的化学结构 图示化合物均用DMSO溶解成浓度为10mg/mL的贮存液，实验前用含10%胎牛血清的α-MEM培养基分别稀释，配制成浓度分别为10μg/mL和5μg/mL的样品溶液。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清的α-MEM培养基，在37℃，含5%CO2条件下培养细胞，待接种于培养板中的细胞密度达100%时，再用含1%胎牛血清的培养基分化为成肌细胞，每两天换1次分化液，于接种后第8天用于实验。

1.2.2 类ELISA法测定细胞膜上L6GLUT4myc 在分化后的L6 GLUT4myc培养板中加入黄酮衍生物稀释液每孔1mL（留空白孔、背景孔和胰岛素孔），24 h后无血清培养3 h[5]，加入100 nmol/L的胰岛素，20min后将培养板置于冰上；用预冷的含1mmol/L Ca2+和1mmol/LMg2+的PBS(+)溶液洗 3次，用 5%(v/v)山羊血清封闭肌管，10min后用抗myc单克隆抗体（1∶500稀释）摇床上冰浴孵育 1 h；PBS（+）洗6次，用含4%的多聚甲醛冰上固定肌管10min，室温固定20min，再用0.1mol/L的甘氨酸冰上淬灭10min，用偶联过氧化物酶HRP的山羊抗兔IgG（1∶1 000稀释）室温孵育 40min；PBS（+）冲洗 6次，加入底物邻苯二胺溶液，20 min后用0.20 mL的3 mol/L HCl溶液终止，490 nm测定上清液吸光度值。计算公式如下：

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件包，对所得数据采用表示，两两比较采用students t检验，P<0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 黄酮衍生物1~14对L6 GLUT4myc转位的影响 本研究应用抗myc的抗体可在保持细胞膜完整的状态下测定转位到细胞膜上的GLUT4量。结果如图1所示，相对于对照组，胰岛素刺激组中GLUT4的量明显上升为对照组的（2.71±0.06）倍（P<0.05），各黄酮衍生物组 1、5、6、8~11在浓度为 10μg/mL时，GLUT4的量分别为对照组的（3.60±0.30）倍、（3.66±0.26）倍、（2.87±0.49）倍、（3.97±0.37）倍、（2.82±0.45）倍、（3.37±0.67）倍、（4.43±0.61）倍（P值均小于0.05），对L6 GLUT4myc细胞GLUT4转位显示了明显地促进作用。

2.2 与胰岛素叠加作用结果 黄酮衍生物6与胰岛素叠加作用结果如图2所示，相对于对照组，胰岛素组、衍生物6组、衍生物6+胰岛素组的GLUT4量明显上升，GLUT4量分别为对照组的(2.71± 0.06)倍、（2.67±0.19）倍、（4.31±0.22）倍（P 值均小于0.05）。结果表明衍生物6不仅促进L6细胞GLUT4的转位，并且与胰岛素具有协同作用。

3 讨论

带有myc表位标记的L6GLUT4myc细胞的GLUT4myc表达量远远超过内源性的GLUT4，无论是基础状态下还是胰岛素刺激状态下的葡萄糖吸收都是由GLUT4myc转运的[6]。因此，根据细胞膜上GLUT4myc数量变化可以推测细胞摄取葡萄糖量的变化。本文实验结果表明，委陵菜黄酮衍生物1、5、6、8~11在 10μg/mL作 用 浓 度 下 显 著 增加L6GLUT4myc大鼠骨骼肌细胞膜表面GLUT4myc的水平，即刺激GLUT4myc的转位。与胰岛素叠加作用实验结果表明，黄酮衍生物6与胰岛素具有协同作用。

虽然文献报道了大量黄酮类化合物的抗糖尿病活性，包括在脂肪细胞（3T3-L1）[7]和肝细胞（HepG2）以及糖尿病模型动物中的抗糖尿病作用[8-9]，但在骨骼肌细胞（C2C12）中的研究仅有1篇报道了橘皮素在100μmol浓度下促进GLUT4的转位作用[10]。本文首次报道了黄酮衍生物在20~30μmol浓度下显著促进骨骼肌细胞L6GLUT4的转位，并与胰岛素存在协同作用，有进一步深入研究的价值。

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