丝素蛋白微球作为药物缓释载体的研究进展

党婷婷，陈爱政，2，王士斌，2

（1华侨大学生物工程与技术系，福建 厦门 361021；2华侨大学生物材料与组织工程研究所，福建 厦门 361021）

进展与述评

丝素蛋白微球作为药物缓释载体的研究进展

党婷婷1，陈爱政1，2，王士斌1，2

（1华侨大学生物工程与技术系，福建 厦门 361021；2华侨大学生物材料与组织工程研究所，福建 厦门 361021）

丝素蛋白稳定无毒、廉价易得，具有良好的降解性和生物相容性等特点，是一种优良的载体材料。本文基于丝素蛋白独特的氨基酸组成结构和自组装形成稳定的β-折叠构象等特点，综述了丝素蛋白微球/粒的制备方法，即酶法、喷雾干燥法、乳化-溶剂挥发法、相分离法、电喷法和超临界二氧化碳流体强制分散法等一些新型技术，及其在药物载体方面缓释特性的应用研究。由于丝素蛋白来源物种间的差异和脱胶过程中不一致性等问题，丝素蛋白改性、复合或基因工程加工处理将是今后的发展方向，在生物医学领域将具有广阔的应用前景。

药物载体；丝素蛋白；微球；制备

自20世纪90年代以来，药物释放系统（drug delivery system，DDS）一直都是药物剂型和制剂研究中的热点。一般是以聚合物作为药物载体，制成一定剂型，从而控制药物在人体内的释放速率[1]，可分为缓控释给药系统、微粒给药系统、靶向给药系统、智能给药系统、经皮给药系统等。

在药物缓释体系中，药物载体扮演着重要的角色，主要分为天然高分子材料、半合成高分子材料和全合成高分子材料3种。其中半合成高分子材料可能存有水解、不耐高温、稳定性差等缺点；全合成高分子材料缺点是在合成过程中，某些残留物质可能不易去除，造成一定毒性；相比而言，天然高分子材料具有生物相容性好、性质稳定、安全无毒、价格低廉等特点，在制剂应用中越来越受重视。近几年来，以丝素蛋白为代表的天然材料正成为药物缓控释载体的研究热点，日益为人们所关注[2-5]。

1 丝素蛋白

桑蚕丝和柞蚕丝是由丝素（70%～80%）和丝胶（20%～30%）组成，其中丝胶为水溶性，丝素一般不溶于水，可溶解于饱和氯化钙/溴化锂溶液中。丝素是一种纤维蛋白，主要由甘氨酸（43%）、丙氨酸（30%）、丝氨酸（12%）等18种组成，可分为重链（～390kDa）、轻链（～26kDa）及P25（糖蛋白链，～28kDa）3部分，比例是6∶6∶1[6]。H链分为氮端、疏水核心重复序列（94%）、亲水负电荷序列及碳端 4部分。疏水核心重复序列是由保守的(Gly–Ala–Gly–Ala–Gly–Ser)n及少量保守的(Gly–A la–Gly–A la–Gly–X)n构成，易形成结晶区，呈β-sheet；非重复亲水负电荷序列是由几乎相同拷贝的43个氨基酸残基组成并穿插其中，称为间隔序列，疏水-亲水易构成两亲区；另外，151个氨基酸残基组成头部序列，58个残基组成C2末端序列，构成了非结晶区域，见图1[7]。

图1 丝素蛋白结构图

丝素蛋白除其来源方便、价格低廉外，与其它药物缓释载体相比，还有如下优越性：①具有良好的降解性和生物相容性，应用体内安全，组织相容性好；②具有良好的力学性能和理化性质，如良好的柔韧性和抗拉伸强度、透气透湿性、缓释性等；③具有SilkⅠ和SilkⅡ构象，SilkⅠ包括无规线团和α-螺旋，SilkⅡ为反平行 β-折叠，是丝素蛋白的稳定结构。二者可通过改变温度、溶剂极性、pH值、应力等条件进行转变[8]；④可塑性强，通过化学修饰某些氨基酸的氨基或侧链，改变其表面性能，处理得到不同形态，如纤维、溶液、粉、膜以及凝胶等。因此，丝素蛋白已成为一种应用前景广阔的药物缓释载体材料[9-11]。

2 丝素微球制备技术

目前，丝素蛋白作为缓释系统主要有以下几个方面：①膜缓释系统[12]，②控释涂层系统[13]，③凝胶缓释系统[14]，④微球[15]、微囊、微粒、纳米粒缓释系统。相比其它体系，微球制剂具有可调控药物释放速度、降低毒性和不良反应等优越性。 而且因微球与某些细胞组织有特殊亲和性， 能够集中于靶区，起到靶向治疗的作用，现已成为医学制剂领域的热点研究对象[16]。下文将着重介绍丝素微球的制备方法，即酶法、喷雾干燥法、乳化-溶剂挥发法、相分离法和电喷法等。

2.1 酶法

酶法是一种高效简便新工艺，可制备颗粒均匀的纳米蛋白肽颗粒。陈忠敏等[17]采用LiBr/CH3OH/H2O溶剂溶解丝素，透析浓缩后用α-糜蛋白酶酶解，颗粒大小降解为80～300 nm，具有优越的抗菌性。目前，研究通过此法制备药物载体的文献较少，但因其绿色而具有一定潜力。

2.2 喷雾干燥法

此法是一种较早采用且很实用的制备微胶囊技术。首先将囊心物质分散在包囊材料的溶液中，然后将此混合液在热气流中雾化，随着溶解包囊材料的溶剂迅速蒸发，囊膜固化，得到包覆囊心物质的微胶囊。Yeo等[18]用喷雾干燥法（流速20m L/min，进气口 85 ℃）制备了呈圆形的丝素微球，平均粒径2～10 μm；微球膨胀率与溶液pH值成正比；分子构象呈β-折叠，这些特性有利于装载药物。Hino等[19]在流速12 g/min，雾化气压3 kgf/cm2，进气口120 ℃时，制得圆形且直径约5 μm的丝素微球。以茶碱为模型药物，二者主要为无定形结构，但将微球暴露于相对湿度89%的空气中，丝素分子构象呈β-折叠。

2.3 乳化溶剂挥发法

该法是将不相混溶的两相通过机械搅拌或超声乳化制成乳剂，内相溶剂挥发除去，成球材料析出，固化成球。由于此过程十分复杂，影响因素众多，质量较难控制，目前，较多是在实验室小批量生产，放大生产尚存在一定困难。在制备丝素微球体系中，常见W/O乳化溶剂挥发法。Srihanam等[20]以二氯甲烷为油相，丝素水溶液为水相，制备了包载牛血清白蛋白的丝素微球。结果表明，微球呈圆形且直径约45～92 μm，分子构象主要为无规卷曲，随着BSA含量增加，微球的释放速率呈增加趋势。Imsombut等[21-22]以乙酸乙酯为油相，采用类似方法制备了京尼平交联的丝素微球，有潜力作为亲水药物的载体。

Park等[23]以癸烷（Span80和Tween80，1∶1）为油相，搅拌速度 600 r/min，得到圆形且粒径为21.6～8.5 μm的丝素微球，其内部结构为紧密或中空状。Baimark等[24]等报道以有机溶剂（乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、氯仿）为油相制备多孔丝素微粒，表明此方法可以实现蛋白质载体在人工细胞微囊化、缓控释给药体系、蛋白质及水溶性活性分子方面的潜在应用。鉴于微球的多孔结构，充当药物载体主要可应用于药物的控制释放、肺部给药和动脉栓塞等[25-26]。此外，Xie 等[27]采用 W/O/W 复乳法制备了粒径6.53～68.60 µm的载地塞米松磷酸钠丝素微球，当丝素浓度为3%或6%时，载药丝素微球有一定的缓释行为。

2.4 相分离法

2.4.1 模板法

模板法（硬模板/软模板）是制备纳米结构材料的常用方法，可用来制备各种形状（如球形粒子、一维纳米棒、纳米管以及二维有序阵列等）的纳米结构。但是目前真正具有工业中试规模的合成方法尚未投入运转，因此还有待于进一步深入研究。模板剂的种类、特点与纳米材料的尺寸、形貌、性能之间的规律性也有待探索，更多的可用于纳米材料制备的模板剂还需要继续寻找。Wang等[28]以脂质体囊泡为模板高效制备载活性蛋白药物（辣根过氧化物酶HRP）的丝素微球，粒径约2 μm且富含β-折叠结构。经甲醇处理，HRP释放仅5%；氯化钠处理后，HRP的释放速率与处理时间有关。他们还通过丝素/PVA共混膜成功制备了包载TMR-BSA、TMR-Dextran、RhB的丝素微球[29]，释药主要取决于药物的性质、电荷和疏水相互作用。这种方法简便安全、易于放大、节省能耗且适合多种药物，因此对于丝素微球传递体系很有意义。

2.4.2 盐析法

依据蛋白质盐析的原理，Andreas等[7]选取磷酸钾盐，制得装载阿尔新蓝、诺丹明B、结晶紫的丝素微粒，粒径约500 nm～2 μm。前3 h ，三者累计释放量为3%、83%、17%，另外，pH值为7时，结晶紫呈快速释放。表明丝素表面为负电荷，它以简单的静电吸附装载小分子带正电荷的药物，体外释放主要与药物、电荷和结构有关。鉴于水溶液工艺、载药过程简单以及二级结构可控，显示了此法制备丝素微粒的潜力。

2.4.3 溶剂-非溶剂法

该法是指在聚合物溶液中，加入一种不溶该聚合物的溶剂，引起相分离而将药物包封形成微囊/微球。张雨青等[30-31]通过将丝素溶液注入过量与水混溶的极性质子有机溶剂中，制备丝素纳米微球。研究表明诱导形成丝素纳米粒的溶剂顺序为：丙酮＞异丙醇＞丙醇＞乙醇＞甲醇＞四氢呋喃＞乙腈。当以丙酮为溶剂时，纳米微球直径为35～125 nm，呈β-折叠，拉曼光谱表明暴露在微球表面的酪氨酸残基数高于丝素纤维表面的残基数。因此这种微球可广泛应用于化妆品、防紫外护肤品、工业原料、酶或药物载体等方面。

Cao等[32]添加乙醇到丝素水溶液中制得可控粒径约0.2～1.5 μm、表面粗糙但无明显黏附的微球，主要为β-折叠结构。在此基础上，为了进一步解决微球的积聚和变形问题，Shi等[33-34]引入 PVA，通过调节丝素、乙醇和PVA的体积比，调控丝素微球的粒径和形貌，自组装制得平均粒径980 nm的丝素微粒，50天仅释放了 23% FITC–BSA 和 34% RhB。Kundu等[35]分别以家蚕和热带印度柞蚕制备丝素水溶液，二甲亚砜为非溶剂，得到粒径约150～170 nm的球形纳米微粒，呈SilkⅡβ-折叠结构，载体无细胞毒性。以VEGF为模型药物，超过三周时，仍具有显著的稳定缓释行为。因此，天然蛋白纳米粒可作为药物载体运输药物到靶细胞，极其简单的制备工艺，可实现这种微粒在癌症诊断及治疗方面的应用。

2.5 电压驱动成球的技术

静电喷射技术是一种制备粒径可控 （从几十纳米到几十微米）、 表面形态可控 （光滑或多孔）高分子微粒的技术。比起传统的微囊化过程，静电喷雾法（电喷法）最突出的两个优势是乳液的省略和高温操作的避免，从而使蛋白质类药物能更好的保持活性，并且可制备出高纯度的微球，操作相对简单，且适合的聚合物种类比较多。邵正中等[36]以再生丝素蛋白水溶液作为电喷原液，经高压静电喷射形成微液滴，再在重力和电场作用下使溶剂迅速挥发，最后通过醇溶剂诱使丝素蛋白发生快速、完全的不溶性β-折叠转变，形成具有单分散性和稳定性的纳米微球。并在原液中添加一定比例的水溶性药物分子和/或磁性粒子混合电喷，可以实现水溶性药物的包埋、可控缓释与靶向传递等。

Gholami等[37]将再生丝素水溶液冷冻干燥成丝素海绵，然后将其溶解在甲酸中得到电喷原液，电喷法制得粒径低至约80 nm的丝素微球，主要为β-折叠结构。Wang等[38]利用静电喷射和冷冻干燥的方法制备了粒径约100～400 μm且呈多孔状的丝素微球，粒径大小与溶液浓度和流速成正比，与电压值成反比，乙醇处理后，丝素的构像主要为Silk Ⅱ结构。因此，本发明工艺在药用载体领域具有广泛的应用前景。

与上述不同，Wenk等[39]在可控振幅、频率及温和的实验条件下，用层流射流分散丝素蛋白水溶液到液氮中，收集冻干制备球形且粒径约101～440 μm的丝素微球。以水杨酸、心得安、类胰岛素生长因子（IGF-I）为模型药物，三者包封率高达100%，心得安和IGF-I有明显的缓释效果，表明此微球可作为敏感型生物制剂的缓控释平台。黄永利等[40]将丝素蛋白溶液经热处理，在低压电场的作用下，正极获得丝素蛋白凝胶，液氮冷冻干燥，可制得粒径200 nm～3 μm的丝素微球。鉴于温和的制备条件（低压电场、室温或者低温、水环境）、丝素蛋白的可降解性及其同药物的良好相容性，丝素蛋白微球体系有望成为缓释带负电荷的蛋白质和基因药物的优良载体。

2.6 其它新型技术

微流体聚焦技术是利用溶液流体在微型管道里面的流动特性，可精确的控制纳米颗粒的形成条件，从而得到分布窄且性质均匀的纳米颗粒。Breslauer等[41]以75%油酸、25%甲醇和2%Span-80混合物为连续相，分散相为丝素水溶液，通过调节两不混溶相的流速得到单分散的液滴，再采用合适的非溶剂甲醇固化成球。研究表明，随着内/外相流速比例增加，粒径减小且分布均匀，半径约为145～200 μm，具有独特的核壳结构且主要为 β-折叠结构，AFM纳米压痕法表明微球出乎意料地软。这些特性，有望其在药物缓控释方面的应用。

超微微粒加工体系 UPPS（ultra-fine particle processing system）包括以下几个主要部分：①转盘；②尖形进料口；③气流系统：向心气流、切向气流、负压气流；④收集器。Wen等[42]将药物/丝素溶液利用UPPS制备微球。通过控制参数，得到具有粒径分布窄、表面光滑密集的微球。EGFP（增强型绿色荧光蛋白）包封率高达 95%，50天周期释放了82%且无突释，表明此工艺可长期缓释蛋白质药物，提高病人的依从性和方便。但对于一些黏性大或溶解度差的材料，此工艺受到限制。另外，Rajkhowa等[43]利用喷射碾磨萃取技术（air jet m ill）制备超细丝素微粒。

超临界流体（supercritical fluid，SCF）技术可解决传统微粒制备工艺耗能大、处理温度高和有机残留超标等问题，已被广泛应用于药物制剂领域[44]。作者课题组已采用超临界二氧化碳流体强制分散法（SEDS）[45-48]制备了多种聚合物药物载体，显示了良好的应用前景；且采用SEDS成功制备了负载吲哚美辛的丝素纳米粒，纳米粒表面光滑且平均粒径约50 nm，载药量2.05%，包封率10.23%，体外释放实验表明丝素微球对吲哚美辛的缓释作用明显，表明此法制备丝素药物载体作为药物缓控释体系的适宜性和可行性[49]。目前正试图通过细胞、分子及整体3 个水平，采用新型生物学评价技术进行丝素药物载体的生物相容性评价，以期为丝素蛋白基药物载体的临床应用提供基础数据。

3 展 望

目前，丝素蛋白在药物缓释方面已经得到一定程度的研究和应用，但还仅仅局限于可行性的论证上，有些也仅仅做了初步的研究。因此，根据药物缓释材料的性能要求，将丝素蛋白改性、复合或基因工程加工处理[50]为实际生产所需要的药用材料将是今后的发展方向。同时，将其应用于临床治疗还需要很长时间，尚有一些问题需要解决，如何实现丝素蛋白降解与其功能发挥同步化，如何实现药物缓释高效化、速效化、长效化等，还需要进一步研究。此外，在丝素蛋白基药物载体临床应用之前，有必要全面性、整体性地对其进行生物学评价以确保其生物安全性。

总的来说，随着生物技术及缓释技术领域的不断拓展，丝素蛋白在药物缓释领域将有更广阔的应用前景。

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Research progress of silk fibroin m icrosphere as sustained-release carrier of drug

DANG Tingting1，CHEN Aizheng1,2，WANG Shibin1,2
（1Department of Biological Engineering and Technology，Huaqiao University，Xiamen 361021，Fujian，China；2Institute of Biomaterials and Tissue Engineering，Huaqiao University，Xiamen 361021，Fujian，China）

Silk fibroin (SF) is stable，non-toxic and cheap，and is an excellent carrier material due to its availability，biodegradability and biocompatibility. Based on its unique amino acids composition and stable structure of self-assemblingβ-sheets， several methods for preparation of SF microspheres/m icroparticles are introduced，such as enzymolysis，spray drying，emulsification solvent evaporation，phase separation，electrospraying，as well as the new technologies of suspension-enhanced dispersion by supercritical CO2(SpEDS)，and their sustained-release characteristics as drug carriers are also reviewed. In addition，it is recognized that challenges remain，including variation of silk between species and between individuals of the same species and inconsistencies in the degumm ing process. The future direction could be developing modified，composite or genetically engineered SF proteins，which would have potential applications in the biomedical field.

drug carriers；silk fibroin protein；m icrospheres；preparation

R 318

A

1000–6613（2012）07–1587–06

2011-11-01 ；修改稿日期：2012-02-29 。

国家自然科学基金（51103049，81171471，31170939）及福建省自然科学基金（2010J05027，2011J01223）项目。

党婷婷（1987—），女，硕士研究生。联系人：王士斌，教授，博士生导师，主要从事生物材料与组织工程方面的研究。E-mail sbwang@hqu.edu.cn。