血管性痴呆大鼠海马DG区几种氨基酸含量的变化

元艺兰 朴虎男 吴 光 崔松彪

血管性痴呆（vascular dementia，VD）是由一系列脑血管因素（包括脑缺血、脑出血或急慢性缺血缺氧性脑血管病等），导致脑组织损害而引起的，以记忆、认知功能障碍为特征的获得性智能损害综合征。它具有发病率较高、致残率较高等特点，但也是老年期痴呆中仅有的可预防和治疗的一种痴呆［1］。目前为止，虽然很多临床资料和基础研究证明VD的发病与脑血管疾病、动脉粥样硬化、高血压病、糖尿病、肥胖、代谢综合征、心脏病、高纤维蛋白原血症、高血粘度、长期吸烟酗酒等诸多因素有关，而且还和病灶的性质也密切相关［2，3］，但其发病的确切机制尚不完全清楚。因此，为了初步探讨与VD记忆认知障碍相关的海马区神经化学机制，本研究以双侧颈总动脉永久性结扎的方法制备VD模型大鼠，并以在大鼠空间学习记忆中起关键作用的海马齿状回（Dentate gyrus，DG）区为研究对象，利用脑部微量透析法和高效液相色谱法观察了细胞外液中几种氨基酸类神经化学物质的含量变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验采用清洁级Wistar系雄性大鼠，体重在250～300克，由吉林大学动物实验中心提供。

1.2 实验分组 将大鼠随机分成3组：对照组6只，不作手术；假手术组6只，剥离双侧颈总动脉，但不结扎；模型组6只（VD组）：剥离双侧颈总动脉，并进行永久性结扎。

1.3 VD大鼠模型的制备 经过多次预实验，我们采用改良的双侧血管阻断（2-VO）法［4］来建立 VD大鼠模型。具体操作为选取健康雄性wistar大鼠，手术前禁食不禁水8～12 h，腹腔注射10%水合氯醛（300 mg／kg）进行麻醉，待大鼠深度麻醉后将大鼠仰卧固定，颈部皮肤剃毛备皮，并进行碘伏酒精常规消毒；于颈部正中央切口，钝性剥离皮下组织，在切口正下方的胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌的交界处（即Y形沟内）可以找到手触之有搏动感、粉红色较粗大血管，即颈总动脉；小心剥离出一侧颈总动脉后，采用4号手术线结扎；以青霉素粉于局部伤口处处理，缝合伤口；7 d后同样方法进行另一侧颈总动脉结扎。假手术组只做剥离不结扎，对照组不做剥离手术。VD组和假手术组，两组手术大鼠术后单独笼养1周后合笼饲养。

1.4 行为学检测 采用Morris水迷宫系统，该系统包括一个直径130 cm、高50 cm的圆形水池，一个水中平台和悬挂在水池上端的记录装置三部分（图1）；实验水深30 cm，水温（20±2）℃；池壁上标有4个对称的入水点，分为东、南、西、北，并以此为中心将水池分为4个象限，选其中任一象限中央放置平台，平台及整个水池内部漆成黑色；平台高度为28 cm，直径为10cm，使平台距水平面1.5～2.5 cm；水迷宫上方的摄像头用来随时记录大鼠的运动轨迹；整个训练期间水迷宫外各种布置保持不变，训练时光源等应一致，保持周围环境安静；造模前和造模30 d后各进行Morris水迷宫训练和检测1次，用来评估手术前后大鼠学习记忆改变；每次训练开始前1 d，为了让大鼠熟悉环境，让大鼠在水池中自由游泳3 min，此时撤出平台；为了评估大鼠的空间学习和记忆能力，我们进行大鼠定位航行实验，设定为每天训练4次，第5次进行测试，共需5 d完成；将大鼠从入水点背向水池中央放置，记录60 s内大鼠从入水到爬上平台所需的时间，即逃避潜伏期；有的大鼠在60 s内能够找到平台，让其在平台上站立10 s，有的大鼠找不到，将大鼠引上平台，并让其停留10 s，此时潜伏期记为60 s。

图1 Morris水迷宫行为学检测系统

1.5 海马区微量透析探针及其外套管固定手术

大鼠用10%水合氯醛（300 mg／kg）腹腔注射麻醉，待大鼠完全麻醉后头部去毛备皮，将大鼠腹卧位固定于立体脑定位仪上；根据Paxinos和Watson所绘制的大鼠脑图谱，将透析探针外套管插入到DG区；DG区定位以前囟为参考点，后退3.1～3.3 mm，旁开（左右皆可）1.9～2.1mm，深度为高于DG区1.5 mm的位置，然后用牙托粉将其固定在大鼠颅骨上；术后把大鼠放在长30 cm，宽30 cm，高35 cm的实验用不透明的塑料小箱中饲养；第2 d大鼠状态恢复后经外套管将透析探针插入到海马DG区，用蜡将探针固定在外套管上，探针超出外套管1.5 mm（前端附有半透膜），待大鼠安静后进行脑部微量透析实验；微量透析探针及其外套管埋入（图2）。

图2 微量透析探针及其外套管的埋入位置模式图

1.6 微量透析样本的收集和氨基酸含量的测定 根据Jin等的方法［5］，微量透析探针连接微量泵，向大鼠海马DG区灌流Ringer’s液，流速为1.5μL／min，待稳定90 min后开始进行样本收集，每管收集量为15 μL，收集10min，保存在－80℃冰箱，以备进行氨基酸含量分析；每只大鼠收集3个管，取其平均值；氨基酸含量测定采用高效液相色谱和电化学检测系统（ECD-300），取12μL样本和4mM 的 OPA 溶液3 μL，混匀在室温下反应2.5 min，抽取上述溶液10μL，通过手动进样口注入到系统中进行分析，其参数为流动液流速：0.5 mL／min，压力＜10 Mp。

1.7 组织学鉴定 待样本收集完后将大鼠麻醉处死，小心剥离脑组织，固定在10%甲醛溶液中，采用连续手动冰冻切片法做厚度为60μm的脑切片，干燥1 d后即可在显微镜下观察。

1.8 统计学处理 所有实验数据均用平均值±标准误（means±SE）表示，采用t检验或单因素方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 VD模型大鼠空间学习记忆能力

造模前对照组、假手术组和VD组大鼠的逃避潜伏期随着训练天数的增加逐渐缩短，各组间无显著性差异（表1）。造模30 d后对照组和假手术组与造模前相似，其逃避潜伏期也随训练天数的增加而明显减小，而VD组的逃避潜伏期虽然也有随训练天数而减小的倾向，但减小幅度缓慢，与对照组和假手术组相比较有显著性差异（表2）。

2.2 组织学鉴定

根据Paxinos ＆ Waston的大鼠脑图谱，对脑切片标本进行了组织学鉴定。图3是一张典型的组织学显微镜照片，图中透析探针位于海马DG区。定位不准确者不计入统计。

表1 造模前各组大鼠逃避潜伏期的比较（s）

表2 造模30 d后各组大鼠逃避潜伏期的比较（s）

图3 微量透析探针位置标记图

2.3 VD模型大鼠海马DG区细胞外液中几种氨基酸含量的变化

假手术组与对照组比较，7种氨基酸的含量均无明显变化（P均＞0.05）；VD组与对照组及假手术组比较，Gln、Tau、Ala和GABA的含量明显增加（P均＜0.01），而Asp、Glu和Gly的含量没有明显差异（P均＞0.05）（表3）。

表3 各组大鼠海马DG区细胞外液中的氨基酸含量（用高效液相色谱图上的波形所占面积表示）

3 讨 论

VD是因脑血管疾病所致的痴呆，在我国是老年期痴呆的主要类型，对它的研究和认识成为人们日益关注的热点。海马是机体完成学习记忆活动的关键结构，海马区的包括氨基酸类在内的多种神经化学物质参与学习记忆功能。有研究指出，VD的记忆认知障碍和海马区的病理变化密切相关［6－9］，然而对于VD记忆认知障碍和海马区氨基酸类物质含量的关系目前报道罕见。VD大鼠模型的制备方法比较多，有3血管闭塞法、4血管阻断法、急性大脑中动脉梗 死 法、双 侧 颈 总 动 脉 结 扎 法 等［4，10，11］。 经过反复的预实验，我们采用了改良的双侧颈总动脉永久性结扎法，即在实行双侧颈总动脉结扎法的时候，将两侧颈总动脉结扎间隔延长为1周，而且在术后1 d内将大鼠进行分笼饲养。此方法制备VD模型，动物存活率较高，而且模型的成功率也大大提高。

血管性痴呆的发病机制一般认为是脑血管病的病灶涉及额叶、颞叶及边缘系统，或病灶损害了足够容量的脑组织，导致记忆、注意、执行功能和语言等高级认知功能的严重受损。随着近几年各种科学技术，尤其是生物技术研究手段的发展，VD的发病机制的研究取得了一些进展，但到目前为止仍然没有对VD的发病机制有一个完整的阐述。本实验以改良的双侧颈总动脉结扎法制备VD模型，并采用微量透析法和高效液相色谱法测定了清醒大鼠海马DG区7种氨基酸（包括Asp、Glu、Gln、Gly、Tau、Ala和GABA）的含量，本实验结果显示VD模型大鼠海马DG区Gln、Tau、Ala和GABA含量明显增加。

脑内Glu代谢的前体物质是Gln，因此Gln对脑功能发挥调节作用可能是通过Glu递质系统起效的，也有研究报道，在脑片培育实验中可以发现Gln可以产生海马穿通通路纤维中80%的Glu［12］。因为以前对于Gln的营养学研究主要集中于其对创伤、感染、手术等急性应激状态下的肠内外营养支持。近年研究表明，Gln可以通过调节神经系统功能来治疗记忆障碍这一脑出血后遗症，同时也可以促进儿童的智力发育，尤其是智力发育不全的儿童效果更佳，并且还参与治疗帕金森氏综合征和防止癜痫间发作［13］。Tau是一种能增强大鼠学习记忆的作用的必需氨基酸，这归功于其能促进神经系统生长发育、增殖分化的作用；Tau增强大鼠学习记忆能力最初启动的脑区可能是颞叶皮层、海马、下丘脑和丘脑等区域，而且它还参与细胞间的信息传递［14］。有研究报道，在清醒大鼠学习记忆活动过程中海马DG区的Gln和Tau明显增加，提示Gln和Tau可能参与海马DG区的学习记忆功能活动中［6］。本研究结果显示VD模型大鼠海马DG区Gln和Tau含量增加，但却伴有学习记忆水平的下降，提示VD记忆障碍中可能出现Tau和Gln的代偿性增加，但也不能排除两者作为VD记忆障碍产生原因的可能性。另外，本实验结果还显示，VD模型大鼠DG区的Gln含量增加并没有伴有Glu浓度的变化，其可能的机制有待于进一步研究。

Ala和Gly都是人体中重要的抑制性氨基酸。它分子量较小，极易通过血脑屏障发挥作用。Ala经Ia类传入纤维兴奋，激活抑制性中间神经元而释放至突触间隙，与突触后膜特异性受体结合，开启Cl－通道引起突触后膜超级化。然而哺乳动物不同脑区切片显示，脊髓、延髓和脑桥等存在着亲和力摄取系统，只是亲和力不如Gly那样高［14］。目前，对Ala和学习记忆的关系尚未见报道。众所周知，GABA对中枢神经元有普遍性的抑制作用。中枢谷氨酸／γ－氨基丁酸（glutamic acid，Glu／GABA）是参与学习、记忆的关键和必须的氨基酸，并且两者起着相反的作用，对学习、记忆起正性调节作用氨基酸为Glu，反之为GABA，二者之间的对立统一关系，两者都不可忽视。本实验结果显示，VD模型大鼠海马DG区内Ala和GABA均明显增加，提示它们可能作为抑制性递质参与VD的记忆认知障碍过程中。

虽然本实验的结果提示海马DG区的Gln、Tau、Ala和GABA可能与VD的记忆认知障碍有关系，但其具体的作用机制和相互关系还有待于进一步研究。

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