1，25-二羟维生素D3对大鼠肾间质纤维化的作用研究

荣智利，张 旭，张翠薇，高 岑，江 燕，马跃荣

泸州医学院病理教研室，四川泸州 646000

肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）是一个多步骤、连续的动态过程，是各种慢性肾脏疾病发展至终末期的共同通路和主要病理改变[1]，其变化的程度和范围决定了肾功能的恶化程度[2-4]。单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）大鼠是一种经典的RIF动物模型，既可短期内致使肾间质纤维化，模拟慢性肾病时肾间质的病理表现，又可使病变局限在肾小管和肾间质，不引起肾小球及其他组织的损伤[5]。近期研究显示，1，25-二羟维生素 D3〔1，25-dihydroxyvitamin D3，1，25-（OH）2D3〕 主要通过与其特异性受体结合发挥经典的骨盐调节作用，并参与免疫调节、调控激素分泌和细胞有丝分裂、抑制细胞增殖、分化及凋亡等过程[6]。 1，25-（OH）2D3受体可选择性表达于肾脏的近曲小管、远曲小管、集合管和髓袢升支[7]，但其是否在RIF形成过程中发挥作用不详。本研究利用1，25-（OH）2D3干预UUO大鼠，观察其对RIF形成有无影响，以探讨其在RIF过程中的作用。

1 仪器与试药

1.1 实验动物

雄性 SD 大鼠，45 只，8 周龄，体重（200±20） g，购自泸州医学院医学实验动物中心。

1.2 药物和主要试剂

1，25-（OH）2D3（Roche 公司，美国），兔抗大鼠 α-SMA 多克隆抗体（Santa Cruz公司，美国），尿蛋白双缩脲试剂盒（Amresco公司，美国）。

2 方法与结果

2.1 实验方法

2.1.1 实验动物分组及处置 45只SD大鼠随机均分为假手术组、UUO 组和 1，25-（OH）2D3干预组，每组各 15只。 采用单侧输尿管结扎建立UUO大鼠模型[8]。1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，局部剃毛和常规消毒铺巾，选腹正中切口依次切开皮肤至腹腔，游离肾脏及输尿管，分别在左侧输尿管近肾盂处和输尿管上1/3处用1-0丝线两次结扎，剪断输尿管，然后逐层连续缝合皮肤。假手术组进入腹腔后仅游离肾脏和输尿管而不结扎离断，余手术方式与UUO组相同。干预组于术后第 1天起每天腹腔注射 30 ng/（kg·d）的 1，25-（OH）2D3[9]，假手术组及UUO组每天腹腔注射等量生理盐水。分别于术后第3、7和14天处死大鼠，每次5只，取梗阻侧肾脏测量其大小及形态，固定包埋后，制片行HE、Masson和α-SMA染色；开胸经心脏取血检测肌酐和尿素氮水平；各组大鼠于处死前1天收集24 h尿液，检测尿蛋白含量。

2.1.2 肾脏病理检查 每张HE、Masson和α-SMA切片随机选取10个不重复视野（×200，HPF），组内求和取其平均值作为每组最终数据。①HE染色判定肾间质损伤及纤维化程度：HE切片依据Radford[10]标准设定8个参数指标（肾小管扩张、小管萎缩、小管上皮细胞空泡变性、间质水肿、间质炎细胞浸润、间质纤维化程度、红细胞管型、蛋白管型），每个参数按0～3分评定（0分，正常；1分，轻度受损，病变范围＜15%；2分，中度受损，病变范围15%～50%；3分，重度受损，病变范围＞50%），由两个观察者盲法评分取其平均值，每个样本的评分为0～24分。②Masson染色判定纤维化程度：Masson染色是用于显示组织中纤维的一种染色方法，染色切片中胶原纤维呈绿色，肌肉、纤维素和红细胞均呈红色，细胞核呈蓝色，正常肾组织中仅肾小管基底膜染成绿色。RIF进程中胶原纤维逐步取代正常肾单位，肾实质萎缩减少。本实验通过对胶原纤维染色，运用Image Pro Plus 6.0图像分析软件计算镜下绿染面积占整个视野的百分比，以了解受损肾脏的纤维化程度。③α-SMA免疫组化染色：在本实验中α-SMA用于标记肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB），其阳性信号为细胞胞浆呈现棕黄色颗粒。运用Image Pro Plus 6.0图像分析软件计算染色阳性细胞的积分光密度值（指将阳性细胞内染色量化为综合面积和灰度值所得到的结果，其值越大，提示抗原表达水平越高，反之亦然）。

2.1.3 肾功能检测 采血后3 000 r/min离心分离血清，于日本7180型全自动生化分析仪上检测血肌酐、尿素氮水平（此血生化检查由泸州医学院附属医院检验科协助完成）；根据尿蛋白双缩脲试剂盒的操作说明，检测24 h尿蛋白含量。

2.1.4 统计学方法

用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，所有数据采用均数±标准差（±s）表示，多组间计量资料比较用单因素方差分析（One-way ANOVA test），两两比较采用 Dunnett-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2.2 肾脏病理学改变结果

2.2.1 肉眼病理改变 假手术组患侧肾脏大小形态正常；UUO组和干预组梗阻侧肾脏均明显肿大，颜色变浅，表面张力增加，有尿液潴留，切面肾实质变薄，肾盂肾盏扩张，皮髓质分界不清，肾乳头缺血萎缩，并随着时间的延长而加重，以UUO组病变更为明显。

2.2.2 光镜下病理改变 ①HE切片假手术组各时间点肾组织无明显改变。UUO组术后第3天肾小管轻度少量扩张，上皮细胞浊肿变性，肾间质轻度水肿，伴炎细胞局灶性浸润；术后第7天，肾小管进一步扩张，以皮髓交界处尤为明显，上皮细胞空泡变性，管腔内见细胞或蛋白，伴炎细胞弥漫性浸润和部分小管间质轻度纤维化；术后第14天，皮髓质变薄，小管扩张明显，甚至扩张呈囊性，部分管腔塌陷，上皮细胞空泡变性显著，出现大量坏死，间质内巨噬细胞、淋巴细胞弥漫性浸润和成纤维细胞增生及胶原形成，纤维化明显，各时间点肾间质评分差异明显，有统计学意义（P＜0.05）。②Masson切片显示假手术组绿染区域主要位于小管基底膜及其周围，小管间质几乎无染色。术后第3天，UUO组皮髓交界区出现轻度纤维化，并随着梗阻时间的延长绿染面积扩大，表现为肾间质进行性增宽，胶原纤维增加，染色加深，各时间点绿染面积所占百分比比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。③假手术组α-SMA仅表达于血管平滑肌细胞，肾小球、肾小管及间质均未见表达。UUO组术后第3天可见肾间质内α-SMA少量表达；术后第7天肾小管上皮细胞出现阳性表达，皮髓交界处出现轻微纤维化；术后第14天表达达到高峰，皮质区和皮髓交界区明显，各时间点α-SMA的累积光密度值（IOD）比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。④干预组与假手术组相比，各时间点各项指标明显增高；而较之UUO组，各时间点各项指标明显改善，其肾损伤、间质纤维化程度及α-SMA阳性率明显改善，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1。

表1 各组大鼠不同时间点光镜下病理改变（±s，n=5）

表1 各组大鼠不同时间点光镜下病理改变（±s，n=5）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与 UUO 组比较，bP＜0.05；与第 3 天比较，cP＜0.05；与第 7 天比较，dP＜0.05

动物处死时间第3天 第7天 第14天HE肾间质损伤评分（分）Masson绿染面积百分比（%）α-SMA的IOD值检查指标 组别假手术组UUO组干预组假手术组UUO组干预组假手术组UUO组干预组1.20±0.84 4.40±1.14a 2.80±0.85ab 3.21±0.33 5.39±0.61a 3.98±0.14ab 197.65±0.87 433.91±23.08a 325.92±20.28ab 1.20±0.45 13.60±2.51ac 9.60±1.14abc 3.26±0.40 12.14±1.57ac 3.98±0.14abc 199.29±3.26 656.55±23.47ac 461.98±21.93abc 1.00±0.71 19.80±1.48acd 14.20±1.30abcd 3.37±0.47 47.19±2.86acd 31.59±2.36abcd 198.23±1.50 856.00±21.15acd 595.54±6.75abcd

2.3 各组肾功能比较结果

图1 各组大鼠第14天肾脏HE、Masson、a-SMA染色比较（×200）

与假手术组相比，术后第3、7和14天UUO组与干预组肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白含量均明显高于假手术组，差异有统计学意义（均P＜0.05），其中第3、7天各指标呈现上升趋势，第14天时表现为下降；与UUO组相比，干预组各时间点各项指标明显改善，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；而假手术组术后各时间点各项指标差异不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表 2。

表2 各组大鼠不同时间点肾功能变化（±s，n=5）

表2 各组大鼠不同时间点肾功能变化（±s，n=5）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与 UUO 组比较，bP＜0.05

动物处死时间第3天 第7天 第14天血肌酐（μmol/L）尿素氮（mmol/L）24 h尿蛋白（mg/24 h）检查指标 组别假手术组UUO组干预组假手术组UUO组干预组假手术组UUO组干预组36.60±0.99 77.46±0.98a 54.42±0.60ab 4.98±0.29 5.04±0.26 7.34±0.17ab 11.64±0.38 13.00±0.24a 12.52±0.39ab 37.10±0.62 148.48±7.49a 83.10±0.77ab 5.04±0.26 18.16±0.36a 11.22±0.36ab 11.56±0.18 23.56±0.47a 16.98±0.47ab 36.94±0.92 69.82±0.98a 52.36±0.69ab 5.04±0.13 10.02±0.23a 8.96±0.27ab 11.58±0.19 15.94±0.34a 13.48±0.43ab

3 讨论

RIF发生机制错综复杂，可概括为细胞外基质增多、肾小管上皮细胞转分化 （epithelial tmesenchymal transition，EMT）和多种细胞因子及血管活性物质的激活与相互作用。近年研究表明，MFB的激活是RIF形成的关键[11]，而其中1/3的MFB由EMT而来[12]，这种EMT的细胞过度增殖，可分泌多种细胞因子致使细胞外基质合成与降解失衡，最终导致RIF的发生。RIF的病理过程是由病变初期的炎症细胞浸润，继而EMT发生和肾间质成纤维细胞活化增殖，共同产生大量细胞外基质并发生沉积，最后肾小管萎缩消失，小管间质纤维化[4]。正常成熟的肾小管上皮细胞表达角蛋白，肾间质细胞表达波形蛋白，均无α-SMA的表达；而MFB是成纤维细胞的活化形式，胞浆内含肌动蛋白，可表达α-SMA。MFB广泛存在于纤维化肾组织中，因此α-SMA作为MFB的重要标志，可指示RIF的病理进程[13]。而RIF又与肾功能关系密切，可作为准确预测肾功能恶化程度的指标[3]。UUO模型是目前研究RIF最常用的较成熟模型，具有无高血压、蛋白尿、血脂异常及毒性损害等特点，适合RIF病理机制和防治的研究[5]。1，25-（OH）2D3主要通过与其受体结合发挥其多样生物学作用，如参与维持钙磷平衡；与其他转录因子相互作用，影响基因转录；与其他激素、生长因子及细胞因子等相互作用，参与联系多个信号传导途径，从而发挥复杂而精细的调节作用。有研究表明，肾功能降低与血清中1，25-（OH）2D3的减少呈正比关系[14]。这就说明1，25-（OH）2D3可通过某些途径对肾功能起保护作用，减缓肾脏的病理改变。

本实验结果显示，随着时间延长，UUO组肾间质损伤和纤维化程度逐渐加重，α-SMA标记阳性的MFB逐渐增多；至术后第14天，肾间质纤维化明显，α-SMA表达达到高峰。而肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白水平于术后第3、7天与梗阻侧肾脏损伤相平行，各项指标明显升高；至第14天，各项指标明显改善，这可能与实验所取血液为全身血液，而此时健侧肾脏发挥了全面代偿作用有关。干预组与UUO组各时间点相比，干预组各项指标改善明显。另有体外实验证明，1，25-（OH）2D3能抑制转化生长因子-β1（tranforming growth factor-β1，TGF-β1）诱发的 α-SMA 表达，并呈剂量依从关系[15]。TGF-β1是目前已知最强烈的促纤维化因子，可诱导EMT和成纤维细胞活化；而1，25-（OH）2D3的体内信号传导途径与TGF-β1存在有广泛交互的作用[16]。 1，25-（OH）2D3在 RIF 中发挥保护作用的可能机制是通过拮抗TGF-β1诱导的EMT和减少蛋白尿而实现的。

RIF是一个多因子参与、多路径调控的复杂病理过程，其机制还有待进一步的研究。本研究对1，25-（OH）2D3在RIF中所起的干预作用作了初步探讨，为进一步研究RIF发病机制及寻找治疗方法提供了一定证据和思路。

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