E.coli DH10B碱性磷酸酶基因的克隆、表达及活性研究

李 军 ，黄 霞 ，姚雪梅 ，陈雪芬 ，齐兴柱

1.热带生物资源教育部重点实验室，海南海口 570228；2.海南大学海洋学院，海南海口 570228

E.coli DH10B碱性磷酸酶基因的克隆、表达及活性研究

李 军1,2，黄 霞2，姚雪梅2，陈雪芬2，齐兴柱2

1.热带生物资源教育部重点实验室，海南海口 570228；2.海南大学海洋学院，海南海口 570228

目的：克隆并表达E.coli DH10B碱性磷酸酶（AKP）成熟肽基因（phoAm），为AKP的定向改构及应用奠定基础。方法：采用PCR法从E.coli DH10B基因组扩增phoAm；将phoAm克隆入表达载体pET28a，再转入E.coli BL21（DE3）进行表达；用免疫金层析法和SDS-PAGE法检测表达的重组rAKP；采用对硝基酚磷酸（pNPP）法测定rAKP的活性。结果：rAKP单体分子量约47 K，活性分析比对照菌提高21.5倍。结论：获得AKP成熟肽基因并得了到具有较高活性的重组rAKP。

碱性磷酸酶；大肠杆菌DH10B；表达纯化；活性分析

碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）是一类非特异性磷酸单酯酶，可催化磷酸单酯的水解[1]。AKP广泛存在于多种细菌、真菌和动物中。不同来源的AKP的相对分子质量和编码序列差异很大，且各种AKP的性质、结构、功能和催化机制也不完全相同。其中，E.coli AKP由phoA基因编码，为同源二聚体金属酶，单体由449个氨基酸组成，相对分子质量为47 K，活性中心包括3个金属原子，即2个锌原子和1个镁原子[2]。

E.coli AKP催化机制明确，底物范围广泛，作为工具酶在表位连锁、组织化学、免疫印迹、突变分析等方面有广泛应用。E.coli DH10B无致病性和耐药基因，是基因克隆的常用受体菌。本研究首次从E.coli DH10B基因组中克隆了AKP的成熟肽基因（phoAm）并进行了表达研究，从而为此种酶的结构、功能和应用研究打下了坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、载体 大肠杆菌菌株E.coliDH10B、E.coliBL21（DE3）、E.coli DH5α及原核表达载体pET28a（+）由热带生物资源教育部重点实验室保存。

1.1.2 试剂 T4 DNA连接酶、限制性核酸内切酶BamHⅠ、HindⅢ、氨苄青霉素、卡那霉素、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、对硝基苯磷酸（pNPP）购自生工生物（上海）有限公司。质粒提取试剂盒、DNA产物纯化试剂盒、Pfu DNA聚合酶购自天根生化科技（北京）有限公司。His标签蛋白纯化试剂盒、重组标签蛋白快速检测试剂盒GoldCassette-HIS购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.1.3 引物 引物设计后由生工生物（上海）有限公司合成。

1.1.4 仪器 UV-2450紫外可见分光光度计（岛津）；超微量黑色石英比色皿（岛津）；PCR扩增仪（2720 Thermal Cycler Applied Biosystems）；凝胶成像系统（BioRad）。

1.2 方法

1.2.1 E.coli DH10B基因组DNA的提取与纯化 E.coli DH10B甘油菌经LB培养液增菌培养后，用天根公司的细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取与纯化。提取的基因组DNA用紫外分光光度法进行评价。

1.2.2 引物设计 从Genbank数据库下载E.coli DH10B的phoA 基因序列（accession number：NC-010473），使用 Primer Premier 6.0和Oligo 7.37辅助设计用于扩增AKP phoAm的引物，为便于克隆进表达载体pET28a中，在引物两端加上适当的酶切位点和保护碱基。设计的引物如下，正向引物（phoAm-F）：5'-GTCATGGATCCCGGACACCAGAAATGCC-3'（BamHⅠ）；反向引物（phoAm-R）：5'-GCGACAAGCTTTATT TCAGCCCCAGAGC-3'（HindⅢ）。

1.2.3 PCR法扩增phoA基因 在0.2 ml PCR管内配制50 μl反应体系，按下述程序进行PCR扩增：94℃预变性3 min；扩增 30个循环， 即 94℃ 30 s→55℃ 30 s→72℃ 2 min；72℃延伸5 min。反应结束后，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测并进行测序。

1.2.4 phoAm基因的克隆 PCR产物经DNA产物纯化试剂盒纯化后，用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切，并与同样经BamHⅠ和HindⅢ双酶切的表达载体pET28a（+）经T4 DNA连接酶连接后，转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞，经LB/kan筛选平板培养后，用菌落PCR鉴定转化子。

1.2.5 phoAm基因的诱导表达 分别接种pET28a-phoAm/BL21（DE3）和 pET28a/BL21（DE3）单菌落至 5 ml LB 培养液中，37℃振荡培养过夜。按1%的比例接种阳性菌液至100 ml LB培养液中，37℃振荡培养，至菌液OD600nm约为0.4时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导，继续培养3 h。

1.2.6 重组蛋白（rAKP）的检测 菌体离心后，加入缓冲液超声破碎，离心取上清液，用免疫金层析法检测6×His标签，用SDS-PAGE法检测表达蛋白。

1.2.7 重组蛋白（rAKP）的纯化 采用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化。对洗脱液进行SDS-PAGE分析并用Bradford法定量。

1.2.8 重组蛋白（rAKP）的活性分析 采用对硝基酚磷酸（pNPP）法测定rAKP的活性。取发酵菌体超声破碎后的上清液，加入测活液，30℃反应10 min，加入终止液终止反应，于波长410 nm处测吸收值。

2 结果

2.1 PCR扩增E.coli DH10B成熟肽基因（phoA）

PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上分析，可见1.4 kb的条带（图1）大小与预期一致。

图1 E.coli DH10B phoAm PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

2.2 重组蛋白（rAKP）的表达与检测

重组菌诱导表达后，取超声破碎后的上清液，分别用免疫金层析法快速检测6×His标签（图2），用SDS-PAGE法检测表达蛋白（图3）。rAKP的分子量约为47 K。

图2 免疫金层析法快速检测His标签蛋白

图3 SDS-PAGE检测诱导表达的rAKP

2.3 重组蛋白（rAKP）的活性分析

rAKP经活性分析，对照菌 E.coli BL21（DE3）的 OD405nm为 0.120，重组菌 E.coli BL21（DE3）/phoAm 的 OD405nm为2.58，即重组菌的碱性磷酸酶活性提高21.5倍。

3 讨论

本研究首次从E.coli DH10B菌株的基因组中克隆了碱性磷酸酶成熟肽基因，并进行了表达、纯化与活性研究。E.coli AKP作为工具酶在表位连锁、组织化学、免疫印迹、突变分析等方面有广泛应用。目前市场上常见的AKP产品有虾碱性磷酸酶（SAP）和牛小肠碱性磷酸酶（CIAP），其中CIAP的活性最高，约为天然E.coli AKP的40倍[3]。与天然提纯的SAP和CIAP相比，E.coli AKP的生产成本低，热稳定性好。由于AKP的构效关系明确，且在定点诱变和结构改造方面积累了一定的经验[4-5]。进一步研究可结合计算机模拟对E.coli AKP的三维结构与催化活性之间的关系进行深入分析[6]，利用当前蛋白质工程的先进技术手段对重组E.coli AKP进一步改构。

[1]Coleman JE,Gettins P.Alkaline phosphatase,solution structure,and mechanism[J].Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol,1983,55:381-452.

[2]Coleman JE.Structure and mechanism of alkaline phosphatase[J].Annu Rev Biophys Biomol Struct,1992,9(21):441-483.

[3]Wanner BL.Overlapping and separate control on the phosphateregulation in E.coli K12[J].J Mol Biol,1983,166:283-308.

[4]MullerBH,LamoureC,LeD.ImprovingEscherichiacolialkalinephosphatase efficacy by additional mutations inside and outside the catalytic pocket[J].Chembiochem,2001,(2):517-523.

[5]王秋颖,李宁,向本琼.大肠杆菌碱性磷酸酶突变体的构建及其结构与功能研究[J].北京师范大学学报:自然科学版,2007,43(6):647-652.

[6]Lopez-CanutV,RocaM,BertranJ,etal.Promiscuityinalkalinephosphatase superfamily,unraveling evolution through molecular simulations [J].J Am Chem Soc,2011,133(31):12050-12062.

Study on cloning,expression and activity of alkaline phosphatase from Escherichia coli DH10B

LI Jun1,2,HUANG Xia2,YAO Xuemei2,CHEN Xuefen2,QI Xingzhu2
1.Key Laboratory of Tropical Biological Resources of Ministry of Education,Hainan Province,Haikou 570228,China;2.Ocean College of Hainan University,Hainan Province,Haikou 570228,China

Objective:To clone and express alkaline phosphatase mature peptide gene of E.coli DH10B for the foundation of directed structural transformation and application of AKP.Methods:phoAm gene was amplified from E.coli DH10B genome by PCR;phoAm gene was cloned into pET28a and transformed into E.coli BL21(DE3);rAKP was detected by immuno-gold chromatography and SDS-PAGE;the activity of rAKP was determined by pNPP method.Results:Molecular weight of rAKP monomer was about 47 K,and activity of rAKP increased 21.5 times compared with the control.Conclusion:AKP matural peptide gene and rAKP with higher activity is acquired.

Alkaline phosphatase;E.coli DH10B;Express and purify;Activity analysis

Q78

A

1673-7210（2012）01（a）-028-03

海南大学211工程研究生教育教学改革研究项目（项目编号：YJG0102）。

李军（1969-），男，博士，副教授，硕士研究生导师；研究方向：生物制药与药物制剂。

2011-08-08）