RP-HPLC法测定消痔灵片中没食子酸的含量

秦贻强 龚 勋 董晓敏

桂林医学院附属医院，广西桂林 541001

消痔灵片由五倍子、白蔹、卷柏、地榆、槐花、牛羊胆酸等六味中药材配伍而成，具有收敛止血、解毒敛疮的功效，用于内外痔疮[1]。原制剂的质量标准中含量测定项以胆酸为控制指标，目前已有报道进行了消痔灵片中芦丁的含量测定研究[2]，然而本研究发现该制剂中的主药五倍子、地榆含有没食子酸等鞣质成分，具有抗菌、抗炎、止血的药理活性。在治疗痔疮的中成药质量标准研究中，没食子酸[3-4]常被认定为指标成分来进行含量测定，因此，本文采用RP-HPLC法对消痔灵片中的没食子酸进行含量测定方法研究，为其质量标准进一步的研究提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1100型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；威玛龙WM2010型通用多媒体色谱工作站；HANGPINGFA2004型电子分析天平（上海精科天平仪器厂）；B2500S-MT型超声仪（上海必能信超声有限公司）。

1.2 试药

消痔灵片（重庆希尔安药业有限公司，批号：100901）；缺五倍子、地榆的阴性对照样品为自制。没食子酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110831-200302）；甲醇为色谱纯，磷酸及其他试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性实验

色谱柱：Sino Chrom ODS-APC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水-磷酸（6∶94∶0.2）；检测波长：266 nm，流速：1.0 mL/min；柱温：（25±1）℃；进样量：20 μL。 理论板数按没食子酸峰计算，不低于3 000。见图1。

图1 高效液相色谱图

2.2 供试品溶液的制备

取本品10片，研细，精密称取0.1 g，置100 mL量瓶中，加6%甲醇90 mL，超声30 min，放冷，加6%甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得。

2.3 阴性对照溶液的制备

按消痔灵片的处方制备不含五倍子、地榆药材的阴性样品，按“2.2”项下方法操作，制成阴性对照溶液，备用。

2.4 测定波长的选择

以6%甲醇为溶剂对没食子酸标准品及消痔灵片样品溶液进行紫外波长扫描，没食子酸在266 nm处有最大吸收，消痔灵片在263 nm处有最大吸收；并将二者进注高效液相色谱仪中测定，测定波长为266 nm时，峰形均较好，故选定检测波长为266 nm。

2.5 线性关系考察

精密称取没食子酸对照品约6 mg，置50 mL量瓶中，加6%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得120 μg/mL对照品溶液，备用。分别精密吸取对照品溶液 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL至10 mL量瓶，加流动相稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件，进行测定。以对照品进样浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标进行线性回归，得回归方程为Y=50 070.45X-4 335.895，r=0.999 1。结果表明，对照品在18～48 μg/mL浓度范围呈良好线性关系。

2.6 方法学考察

2.6.1 精密度实验 取同一浓度的对照品溶液，连续重复进样6次，测定没食子酸峰面积平均值，求得RSD=0.39%。表明仪器精密度良好。

2.6.2 稳定性实验 取同一供试品溶液，于 0、2、4、6、8、10、12 h各进样一次，测定峰面积积分值。求得RSD=0.55%。表明供试品溶液中没食子酸在12 h内稳定性良好。

2.6.3 重复性实验 精密称取同一批样品6份，按上述供试品溶液制备方法和色谱条件测定没食子酸峰面积积分值，求得RSD=2.19%。表明该方法重复性良好。

2.6.4 加样回收率实验 取已知含量的同一批号供试品约0.05 g，精密称定6份，分别加入适量的没食子酸对照品，按供试品制法制备和上述色谱条件下测定，平均回收率=99.75%，RSD=0.97%。见表1。

2.7 样品含量测定

按上述方法测定批号为100901的消痔灵片样品，平行条件下提取测定3次，计算得平均值，求得每片消痔灵片（每片质量为0.2 g）含没食子酸为6.39 mg/片。

3 讨论

消痔灵片的组方中，五倍子、地榆与白蔹三种药材均含有没食子酸，而没食子酸具有的抗菌、抗炎、抗病毒等作用与消痔灵片抗菌、抗炎、止血的功效相吻合[5]。消痔灵片的原标准建立了以五倍子、地榆对照药材及芦丁对照品的薄层色谱定性鉴别，含量测定项选择了胆酸为测定指标，未能很好体现该制剂中有效成分没食子酸的含量控制。因此为更好地控制消痔灵片的质量，本研究在其原质量标准基础上，采用高效液相色谱法测定了没食子酸总含量，为综合评价该制剂的内在质量及开发利用提供科学的实验依据。

表1 没食子酸加样回收率试验结果（n=6）

本文在实验中发现，以甲醇溶液制备的没食子酸对照品的色谱峰峰形不佳，而以含甲醇-磷酸的水溶液制备的没食子酸对照品溶液和供试品溶液则峰形良好。以甲醇溶液、6%甲醇、30%甲醇、50%甲醇四种溶剂的提取效率，结果表明，甲醇溶剂提取率较低，其他三溶剂的得率无明显差异，但用6%甲醇提取的溶液杂质较少，颜色较浅，因此选择6%甲醇为提取溶剂。实验中曾观察到柱温的变化会影响不同图谱中同一色谱峰的保留时间，为获得重现性较好的色谱图及相应的峰面积，必须保持柱温恒定。

[1]中国药典委员会.卫生部药品标准[M].北京：人民卫生出版社，1998：275.

[2]王宝琴.中成药质量标准与标准物质研究[M].北京：中国医药科技出版社，1994：106.

[3]杜敏，颜仁梁.HPLC法测定复方盐肤木化痔胶囊中没食子酸的含量[J].中药新药与临床药理，2011，22（1）：102-104.

[4]毛长智，张赟赟，甘露.HPLC法测定消痔软膏中没食子酸的含量[J].中医药导报，2010，16（9）：99-100.

[5]陈新玉，李健和，黎银波，等.地榆、地榆片、地榆炭的质量标准研究[J].中国医药导报，2011，8（17）：64-67.