海洛因中毒者血浆类胰蛋白酶及类糜蛋白酶含量的测定

武文杰 郭相杰 郭红民 杨 凯 高彩荣

1.山西医科大学法医学院，山西太原 030001；2.太原市公安局迎泽分局，山西太原 030001

海洛因中毒者血浆类胰蛋白酶及类糜蛋白酶含量的测定

武文杰1，2郭相杰1郭红民2杨 凯1高彩荣1

1.山西医科大学法医学院，山西太原 030001；2.太原市公安局迎泽分局，山西太原 030001

目的 探讨海洛因中毒为代表的非变态反应性过敏反应患者血浆类胰蛋白酶及类糜蛋白酶的含量变化及其机制。 方法 对照组为22名正常人，实验组1为19例海洛因中毒者，实验组2为20例颅脑外伤患者，实验组3为22例初发急性心肌梗死患者。应用ELISA方法检测对照组和实验各组血浆胰蛋白酶及类糜蛋白酶含量。 结果 三组实验组与对照组比较血浆胰蛋白酶及类糜蛋白酶含量差异有统计学意义（P＜0.05），即实验组血浆类胰蛋白酶和类糜蛋白酶含量较对照组均升高，而三组实验组间两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论 海洛因中毒、颅脑创伤与心肌梗死者血浆类胰蛋白酶及类糜蛋白酶含量均增加，提示在非变态反应性过敏反应及上述两种疾病患者均伴有肥大细胞脱颗粒或溶解，类胰蛋白酶和类糜蛋白酶含量升高可以作为非变态反应性过敏反应的诊断依据之一，但应排除急性心肌梗死和颅脑损伤，或者联合其他指标综合判断。

类胰蛋白酶；类糜蛋白酶；海洛因中毒；颅脑创伤；急性心肌梗死

严重过敏反应（anaphylaxis）是一种严重的、危及生命的全身性超敏反应，除IgE介导机制以外，还存在非IgE介导免疫机制，包括IgG抗体免疫复合物、补体相关性和凝血系统的激活[1-2]，新的命名方法将上述途径发生的过敏反应统称为变态反应性过敏反应。与其免疫机制不同的是非免疫途径机制，包括运动、冷空气或冷水等物理及化学性的直接刺激和一些药物，如吗啡、海洛因以及增溶剂、造影剂、麻醉剂、脂质体等作用。最新调查研究表明，临床发生的急性严重过敏反应约77%为此类型[3]。非免疫途径机制是通过引起肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒从而诱发严重过敏反应。Jeziorska[4]在研究人颈动脉粥样斑块时发现，与正常内膜相比，斑块处的肥大细胞数量升高，并处于脱颗粒状态；而Erik等[5]在对创伤死亡者血清类胰蛋白酶的研究中，发现类胰蛋白酶含量升高。为此本文选取海洛因中毒者作为类过敏反应的研究对象，另收集正常人群、颅脑创伤及急性心肌梗死患者血浆，采用ELISA夹心法对上述患者的血浆类胰蛋白酶和类糜蛋白酶含量进行检测，探讨类过敏反应与上述三种情况之间两指标的区别。

1 材料与方法

1.1 材料

对照组收集健康人血浆22份，由太原市江阳工厂医院体检中心提供；实验组包括海洛因成瘾者血浆19份，由太原市戒毒所提供，颅脑创伤者血浆20份，由山西医科大学第一医院提供及初发心肌梗死患者血浆22份，由山西医科大学第二医院提供，分别作为实验组1、实验组2、实验组3。各组年龄最大值及最小值分别为对照组最大75岁，最小23岁；实验组1最大49岁，最小21岁；实验组2最大72岁，最小12岁；实验组3最大67岁，最小38岁。各组年龄段分布见表1。

由表1可见，对照组各年龄段随机分布，实验组的年龄段分布符合该组发病（发生）规律。吸毒人员主要集中在青壮年，颅脑外伤患者主要由意外、车祸及暴力等原因造成，各年龄段均有分布，以男性为主，初发心肌梗死患者多发于中老年，也有发病年轻化的趋势。

1.2 酶联免疫法测定血浆类胰蛋白酶及类糜蛋白酶含量

人类胰蛋白酶及类糜蛋白酶检测试剂盒购于北京索来宝公司。ELISA试验测定所用仪器为第四军医大学的DG3022酶联免疫检测仪。

各组抽取全血后立即2 000 r/min离心20 min，收集上层血清，置-70℃冻存备用。使用前室温复融混匀。

ELISA操作步骤：①标准品的稀释：在酶标包被板上设标准品孔10孔，每两孔为同一浓度，制备类胰蛋白酶浓度分别为 4 800、3 200、1 600、800、400 ng/L， 糜蛋白酶浓度为300、200、100、50、25 ng/L 的标准样。 ②加样：每个指标检测设立两个空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）及待测样品孔，每孔加稀释度5倍待测样品50 μL，轻晃混匀。③温育：用封板膜封板后置37℃温育30min。④洗涤：揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。⑤加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外。⑥重复③④步骤。⑦显色：每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。⑧终止：每孔加终止液50μL，轻轻混匀30 s，确定蓝色变为黄色。⑨终止反应后15min以内进行测定，以空白对照调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组及实验各组类胰蛋白酶及类糜蛋白酶含量测定

对照组及实验各组类胰蛋白酶及类糜蛋白酶含量见表2。

由表2可见，实验组类胰蛋白酶及类糜蛋白酶含量较对照组差异有统计学意义（P＜0.05），即海洛因中毒者、颅脑创伤及急性心肌梗死患者血浆类胰蛋白酶及类糜蛋白酶较对照组显著升高，但三组实验组间类胰蛋白酶及类糜蛋白酶含量差异无统计学意义（P＞0.05）。提示上述三种情况收集的血浆，仅通过类胰蛋白酶及类糜蛋白酶两指标无法区分。

表1 对照组和各实验组年龄分布（例）

表2 对照组和实验组类胰蛋白酶及类糜蛋白酶含量测定（，ng/L）

表2 对照组和实验组类胰蛋白酶及类糜蛋白酶含量测定（，ng/L）

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别 类胰蛋白酶 类糜蛋白酶对照组（n=22）实验组 1（n=19）实验组 2（n=20）实验组 3（n=22）F值P值1297.1±442.6 4386.6±1467.6*4623.4±1542.6*4485.8±1985.1*98.54＜0.05 122.3±41.8 457.4±134.8*475.2±143.1*441.3±128.5*168.26＜0.05

3 讨论

近年来类胰蛋白酶及类糜蛋白酶的应用越来越受到人们的重视，特别是在过敏性休克的诊断中，常被用来作为重要的诊断标准，但随着人们对急性过敏反应认识的加深，发现非变态反应性过敏反应以及其他多种情况均会导致类胰蛋白酶类糜蛋白酶升高，与肥大细胞脱颗粒及细胞膜破坏密切相关。有学者报道，除过敏反应性疾病外，肥大细胞至少还参与了35种非变态反应性疾病的发病过程[6]。肥大细胞胞浆颗粒中除类胰蛋白酶及类糜蛋白酶等中性蛋白酶以外，还包含组织胺、羧肽酶A3和蛋白多糖等。

海洛因化学名为二乙酰吗啡，俗称“白面”，最早由英国Wright医师于1874年合成，1898年德国开始规模化生产该药，由于其优良的镇痛作用及强烈的成瘾性和毒性，使其成为迄今滥用倾向最大、依赖潜力最强的吗啡衍生物。海洛因中毒者临床表现为昏迷、瞳孔缩小（针尖样瞳孔）和呼吸抑制，同时出现心动过缓和血压下降。有48%～80%的海洛因中毒者伴有肺水肿，症状表现与过敏反应相似。早在1880年Osler就发现海洛因中毒者肺充血、水肿、出血和呼吸衰竭的病理生理表现[7]。海洛因在体内的毒理作用还包括中枢神经细胞不同程度变性、坏死、灶性血管周围出血、急性脑水肿等，上述非特异性的类过敏样反应，是导致海洛因急性中毒死亡的主要原因。Edston等[8]进一步研究发现，海洛因中毒死亡者血中吗啡浓度低于0.2μg/mL，不能产生明显呼吸衰竭，而血浆类胰蛋白酶含量的升高开始越来越受到人们重视。之后有学者用抗层粘连蛋白和胶原质Ⅳ的抗体对海洛因中毒引起肺水肿死亡的肺标本进行了免疫组化检测，发现肺毛细血管壁周围有类胰蛋白酶免疫染色阳性细胞出现，提示类胰蛋白酶与肺泡基底膜破坏有关，基质金属蛋白酶的激活起关键作用，而肺泡基底膜的破坏是导致肺水肿及呼吸衰竭的重要原因[9]。作为引起非变态反应性过敏反应代表的海洛因中毒者或死者由于非免疫机制所导致的肥大细胞脱颗粒引起的血浆类胰蛋白酶及类糜蛋白酶高表达，已经越来越成为研究的重点。

有学者在研究类胰蛋白酶及类糜蛋白酶中发现，动脉粥样斑块的稳定性与类胰蛋白酶激活基质蛋白酶有关[4]，类胰蛋白酶还可以通过促进黏附分子表达，起到聚集炎症细胞、促进梗死区修复、对组织碎片吞噬和再吸收以及促进血管再生的作用[10]；类糜蛋白酶可以通过将血管紧张素Ⅰ转化为血管紧张素Ⅱ发挥心脏组织重塑作用[11]。创伤性休克中的血压等生命体征变化，就与急性创伤刺激肥大细胞脱颗粒及破坏肥大细胞释放出类胰蛋白酶和类糜蛋白酶等活性物质有关，与促进释放儿茶酚胺、缓激肽以及其他血管活性物质并激活补体系统也有关联。基于此观点，本试验除选择海洛因中毒者外还测定了颅脑创伤者（实验组2）及初发心肌梗死患者（实验组3）的血浆标本中类胰蛋白酶和类糜蛋白酶。

正常情况人体血浆类胰蛋白酶的基础值为0.8～1.5 ng/mL（应用瑞典Pharmacia&Upjohn AB公司UniCAP类胰蛋白酶FEIA检测仪及相应试剂测定），浓度大于15 ng/mL时为非正常升高。而实际操作中，海洛因成瘾者中毒症状的认定与取血时机对肥大细胞脱颗粒有一定影响，由于症状不够典型或症状缓解后取血，都会使类胰蛋白酶及类糜蛋白酶的实测值与预期有差异。Erik等[5]在创伤死亡者血浆中测得类胰蛋白酶一般在10 ng/mL以上。后来的实验中发现由于肥大细胞多分布于心脏及肺脏，而类胰蛋白酶、类糜蛋白酶的释放又与组织损伤程度有关，所以两者在复合创伤者中浓度要大于单纯创伤，胸部创伤及挤压损伤实测值要大于其他部位创伤[12]，这就造成单纯颅脑损伤患者血浆中测得类胰蛋白酶-类糜蛋白酶与文献记录有一定差异。急性心肌梗死患者也存在发病程度与取血时机的影响。

本实验结果表明，在临床与法医病理学检案中，应用类胰蛋白酶、类糜蛋白酶对过敏性休克诊断和认定时，应排除海洛因中毒等非变态反应性过敏反应以及创伤、急性心肌梗死等情况，如要区别上述原因以外的其他诱因是否导致过敏性反应，应结合其他指标（如IgE、组织胺）以及临床表现综合判断，同时，类胰蛋白酶及类糜蛋白酶的变化也为海洛因中毒者诊断拓展了新的研究方向。

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M easurment of tryptase and chymase p lasm contents of heroin intoxation person

WUWenjie1,2GUOXiangjie1GUOHongmin2YANGKai1GAOCairong1
1.Department of Forensic Medicine,Shanxi Medical University,Shanxi Province,Taiyuan 030001,China;2.Yingze Station of Taiyuan Public Security Bureau,Shanxi Province,Taiyuan 030001,China

Objective To approach the change of plasma trypatase and chymase contents and itsmechanisms of heroin intoxation persons stand with non-allergia anaphylaxis.Methods22 cases of normal people were divided into control group;19 cases of heroin intoxation person were divided into experimental group 1;20 cases of brain injury patientswere divided into experimental group 2;22 cases of patientswho were attacked acutemyocardial infarction firstly were divided into experimental group 3.The level of plasma tryptase and chymase weremeasured in all groups by ELISA.Result s The plasma tryptase and chymase levels of the control group were differences between the three experimental groups (P＜0.05),the plasms tryptase and chymase levels of the experimental group were higher than those of the control group;but there were no statistic significance between any two groups of the three experimental groups(P＞0.05).ConclusionThe tryptase and chymase level of heroin intoxation person,brain injury patients and myocardial infarction patientswere all increased.It indicates that there aremast cell degranulation or lysis in the non-allergia anaphylaxis and other two diseases.The higher level of tryptase and chymase in plasm is one of the diagnostic criteria in diagnosis of the non-allergia anaphylaxis,which should get rid of acutemyocardial infarction and brain injury,or combined with other index for synthetic judgment.

Tryptase;Chymase;Heroin intoxation;Craniocerebral injury;Acutemyocardial infarction

R595.4

A

1673-7210（2012）05（a）-0089-03

山西省回国留学人员科研资助项目（2009-51）；山西省国际科技合作项目（2010081063）。

武文杰（1982-），男，山西太原人，2009级法医病理学在读硕士研究生，主要从事临床医学及法医病理学工作。

高彩荣（1960-），女，汉族，山西夏县人，医学博士，教授，博士生导师，主要从事法医病理学的教学、研究和检案工作。

2012-02-10 本文编辑：程 铭）