单采血小板保存期间部分参数的改变及其意义

曹 惠 卓海龙 徐丽娟 王海平 王全立

1.解放军总医院输血科，北京 100853；2.军事医学科学院附属医院输血科，北京 100039

血小板是止血机制中的一个重要因素，具有止血、凝血、修补破损血管的功能。血小板输注适用于血小板生成障碍、功能障碍性疾病及预防性血小板输注患者。血小板在收集、离心、存储期间，若条件不当而被激活，可造成“储存损伤”影响血小板质量，导致输注无效[1]。本文检测并分析机采血小板在22℃震荡保存过程中发生的一系列形态和功能的变化，旨在为临床输注血小板和评价血小板输注效果提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究使用血小板均取自2008年5月～2010年5月解放军军事医学科学院附属医院输血科，血小板为机采血小板，置于22℃震荡仪上储存。

1.2 仪器与试剂

xs-800i全自动血细胞分析仪及配套试剂（Sysmex公司，试剂均在有效期内使用），XHZ-1型血小板恒温振荡保存箱（华通公司），Anti-human CD62p（eBioscience 公司），Human S1P Elias Kit（北京UBIO生物技术公司）。

1.3 方法

1.3.1 样本收集

随机抽取本中心采集的机采血小板16份，在无菌环境下收集保存 1、3、5、7 d 的血小板 3 mL。

1.3.2 检测指标

1.3.2.1 血小板常规参数检验 使用Sysmex xs-800i全自动血细胞分析仪检测血小板体积分布宽度（platelet distribution width，PDW）、 血小板数（platelet，PLT）、 平均血小板体积（meam platelet volume， MPV）

1.3.2.2 血小板活化率的检测 收集血小板悬液1 mL，将其1 500 r/min离心5 min后弃上清，用PBS缓冲液重悬血小板，调整血小板浓度至 5×106/mL，加入 5 μL CD62p-FITC 室温避光孵育30 min，PBS缓冲液洗涤两次后，以500 μL PBS重悬血小板，即刻上流式细胞仪检测。

1.3.2.3 血小板悬液中S1P（1-磷酸鞘氨醇）浓度检测 收集血小板悬液1 mL，12 500 r/min离心5 min后，上清分装于-20℃冻存待检。按照UBIO公司的Human S1P（sphingosine-1-phosphate）检测试剂盒的操作步骤操作。

1.4 统计学方法

2 结果

不同保存时间的机采血小板的检测结果见表1。

由表1可见，血小板常规参数检验：机采血小板在保存1、3、5、7 d后，检测其常规指标显示，PDW呈上升趋势，PLT呈下降趋势，MPV呈上升趋势。活化率：机采血小板在保存1、3、5、7 d 后，检测其活化率（CD62p 表达率）显示，随着保存时间的延长，活化率有上升的趋势。S1P浓度：机采血小板在保存1、3、5、7 d后，检测其保存上清中的S1P浓度显示，随着保存时间的延长，在前5 d S1P1浓度有上升的趋势，在第7天有所下降。

3 讨论

MPV是经血液分析仪测量后求出的血小板平均体积，代表单个血小板的平均体积。PDW是血小板体积的变异度，是由血液分析仪对血小板分布情况进行数据分析后得到的，反映血小板的离散度[2]。本实验结果显示，在血小板的保存过程中，MPV和PDW的数值都呈上升趋势，说明血小板的体积变大，离散度增加。同时结合血小板的活化率升高，推测血小板在保存中有部分被活化，可能肿胀和伸出伪足，导致体积增大，并且与没有活化的血小板的体积间形成差距，导致PDW的升高。有研究发现，PDW在血小板活化和聚集时变化明显，可作为血小板活化的新指标[3]。本研究显示，PLT下降，可能是部分血小板由于新陈代谢衰竭或其他原因导致凋亡，而又没有新的血小板生成所致。

表1 不同保存时间的机采血小板的检测结果（±s）

表1 不同保存时间的机采血小板的检测结果（±s）

注：与保存 1 d 比较，*P<0.05，**P<0.01；与保存 3 d 比较，#P<0.05，##P<0.01；与保存 5 d 比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01

指标 保存1 d 保存3 d 保存5 d 保存7 d PDW（%）PLT（109/L）MPV（fL）活化率（%）S1P浓度（nmol/L）9.93±1.05 936.83±47.83 8.95±0.60 34.88±1.63 323.53±125.62 9.90±1.02 931.00±64.72 9.08±0.54 48.79±3.51*469.33±104.32**11.92±0.71*#786.33±100.86**##10.28±0.18**##43.42±29.3 481.15±124.69**14.37±2.94*#742.83±128.07**##11.23±1.05*#▲72.86±5.51**#373.34±144.3▲▲

血小板P-选择素贮存在血小板的颗粒中[4]，正常情况下血小板表面无P-选择素表达或呈持续低表达状态，当细胞受到刺激后颗粒膜就会与微管系统的表面融合[5]，导致CD62P分泌到表面，被认为是反应血小板活化的敏感标志之一[6]。血小板的活化通常与代谢率有关，随着介质中乳酸盐含量的增加，血小板被活化并释放α颗粒，进一步引起其他血小板的活化。本研究考察血小板活化，采用了CD62p这一目前公认的反应血小板活化的指标。结果显示，机采血小板在保存期间，活化率逐渐上升，尤其在第7天时，血小板的活化率达到73%。我国和美国血库协会（AABB）目前规定机采血小板22℃振荡保存时间为5 d，也与血小板的活化有关。

S1P是溶血磷脂的中间代谢物，广泛存在于血液、淋巴液、红细胞、中性粒细胞、血小板等体液和细胞中。血小板由于缺乏S1P降解酶类而蓄积S1P，当受到凝血酶、钙离子及血流剪切力等因素刺激时，血小板活化后释放S1P到血浆[7]。基于这一原理，本研究检测血小板保存血浆中的S1P浓度，可以间接反映血小板的活化程度。结果显示，在血小板保存1～5 d过程中，血浆中的S1P浓度呈上升趋势，说明随着血小板储存时间的延长，血小板活化并释放S1P；在第7天时，S1P浓度有明显下降，可能是血浆中存在一些鞘氨醇水解酶，血小板释放S1P的速率低于血浆中S1P的水解率所致，但具体原因还需要更多的实验和研究来进一步探究。

综上所述，本研究的结果显示，机采血小板在22℃震荡保存过程中可发生一系列变化，包括MPV和PDW的升高，PLT的下降，活化率的增加和血浆中S1P浓度的上升。这一系列的变化都提示血小板在保存期间发生一定程度的活化，甚至凋亡，提示其可能是血小板输注无效的原因。在临床血小板输注过程中，对输注血小板剂量的判定和输注效果评价时，应考虑到血小板保存过程中各项指标和功能的变化[8]。

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