不同培养基和促成熟组合对人外周血来源树突状细胞发育的影响

金 悦1,2,3 张 斌2,3▲ 陈 虎2,3▲

1.解放军军医进修学院，北京 100853；2.军事医学科学院附属医院造血干细胞移植科，北京 100071；3.军事医学科学院细胞与基因治疗中心，北京 100071

树突状细胞（dendritic cell，DC）是目前公认的体内功能最强大的专职性抗原提呈细胞（antigen-presenting cell，APC），它能激活静止型T细胞，是启动、调控、维持免疫反应的中心环节，并在肿瘤、器官移植、感染等领域显示出免疫治疗的有效性。但人体内大部分DC处于非成熟状态，表达低水平的共刺激因子和黏附因子，体外激发同种混合淋巴细胞增殖反应的能力较低，成熟的DC表达高水平的共刺激因子和黏附因子，在成熟的过程中，由接触抗原的外周组织迁移进入次级淋巴器官，与T细胞接触并激发免疫应答。2011年，美国洛克菲勒大学教授、免疫学家Ralph MS因“发现树突状细胞及其在获得性免疫中的作用”获得诺贝尔生理学和医学奖。树突状细胞也因此再一次成为人们研究的焦点。DC在肿瘤、感染、器官移植等领域已显示出其免疫治疗的有效性及可行性，但体内DC数量极少，在外周血单个核细胞中所占比例低，故目前临床所用DC多是采集DC前体细胞后，经体外培养得到成熟DC细胞[1-2]。然而，人的DC培养体系不同，体外得到的DC数量也不同，DC的功能也有较大差异，因此，本课题组对比两种培养基和不同促成熟因子组合对人外周血来源DC发育的影响，旨在为优化人外周血来源DC培养体系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

淋巴细胞分离液（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，临床使用标准Cat LTS1077）；重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（recombinant human GM-CSF，rhGM-CSF），重组人白细胞介素（recombinant human interleukin，rhIL）-4，重组人肿瘤坏死因子-α（rhTNF-α）购自美国PeproTech公司，重组人白细胞介素（recombinant human interleukin，rhIL）-1β，重组人白细胞介素（recombinant human interleukin，rhIL）-6购自美国 PeproTech 公司，前列腺素 E2（Prostaglandin E2，PGE2）购自美国Sigma公司；RPMI 1640细胞培养液购自某公司，CellGro无血清树突状细胞培养基购自A公司，无血清培养基X-VIVO 15TM购自B公司，细胞因子定量检测酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自中国深圳达科为生物技术有限公司。

1.1.2 主要仪器

超净工作台；二氧化碳恒温培养箱；倒置显微镜（OLYMPUS）；流式细胞仪（FACS Calibur，BD 公司）；全自动酶标仪；电动移液器（Eppendorf）；6孔、12孔细胞培养板若干。 25、15、10 mL移液管若干。

1.2 人外周血来源DC的体外培养方法

1.2.1 人外周血单个核细胞的获取

采集肿瘤患者静脉外周血60 mL，肝素钠抗凝（20 U/mL全血），生理盐水等量稀释。在处于正常工作状态的生物安全柜中，将采血袋中血液分装到两个50 mL离心管中，用生理盐水补足每管至40 mL。平衡后，以转速2 000 r/min在20℃下离心8 min。将上述离心管中的血细胞与0.9%生理盐水用30 mL生理盐水悬起混匀后，缓慢加到含有15 mL室温Ficoll的50 mL离心管中。平衡后，以转速2 000 r/min在20℃下离心20 min（无离心刹车状态）。离心完毕后，用10 mL移液管仔细小心吸取第2层白膜层细胞到新50 mL离心管中，每管中白膜层细胞8～15 mL。向上述离心管中加入0.9%生理盐水至40 mL，以转速1 800 r/min在20℃下离心8 min，弃上清后，加入2 mL 0.9%生理盐水进行重悬。向上述细胞重悬后的离心管中加入0.9%生理盐水至30mL，以转速1600r/min在20℃下离心8 min，弃上清后，加入2 mL 0.9%生理盐水进行重悬。向上述离心管中加入含0.9%生理盐水至30 mL，以转速1 400 r/min在20℃下离心8 min，弃上清后，加入2 mL无血清培养基进行重悬。需要注意的是，清洗PBMC白膜时，3次离心速度必须要梯度降低，以尽可能地除去血小板。末次离心后，吸去上清，加入RPMI 1640液重悬细胞，调整细胞密度为 3×106/mL， 分别加入 12 孔板中，1 mL/孔，37℃、5%CO2孵箱中培养2～4 h，轻轻洗出悬浮细胞（留作后用），贴壁细胞为单核细胞。

1.2.2 DCs的体外诱导

轻轻洗去完全贴壁4 h的单核细胞培养板中的RPMI 1640 液，分别加入含 GM-CSF（100 ng/mL）、IL-4（200 ng/mL）的CellGro和X-VIVO两种不同培养基，37℃、5%CO2孵箱中培养，第3天半量换液1次。培养第6天，向两种培养基中加入两种不同组合的促成熟因子，第一种组合为：TNF-α（10ng/mL）、IL-1β（10 ng/mL）、IL-6（1 000 U/mL）、PGE2（10 ng/mL），简称鸡尾酒组1，设两个副孔。第二种组合为：TNF-α（10 ng/mL），简称TNF-α组，设两个副孔。对照组不添加任何促成熟因子。将六组DC按表1编号。具体见表1。

表1 六组DC编号

1.2.2.1 DC的形态学观察 用倒置显微镜每日观察细胞生长情况及形态的变化情况，第6天和第8天用0.4%台盼蓝对三组DC进行染色，观察细胞存活率。细胞的存活率计算公式：存活率=染色阴性细胞数/细胞总数×100%。

1.2.2.2 DC的表型分析 培养第8天，将六组DC收获，分别用 4℃的 PBS洗涤两次，重悬细胞数为 5×106/mL，加入Eppendor管中，每管200 μL，按照制造商说明的方法加入抗CD80、抗 CD83，置 4℃冰箱 30 min，然后用 4℃ PBS洗涤两次除去游离荧光抗体，上机进行流式细胞表型分析。用对照组作阴性对照，用阳性细胞比例来表示DC表型和成熟度。

1.2.2.3 细胞因子检测 培养第8天，采用双抗夹心酶联免疫吸附测定法（ELISA）分别检测六组DC上清液中IL-12p70、IL-10的含量，方法按照商家说明进行，建立标准曲线，每组3个复孔，每组试验重复6次。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 树突状细胞的培养形态

从倒置显微镜下观察两种培养基培养的细胞形态可以看出，在培养初期X-VIVO培养基培养的DC繁殖较快，但随着培养时间的延长，CellGro培养的细胞繁殖情况也与XVIVO基本一致。观察培养第6天和第8天的DC，可见两种不同培养基培养的iDC和mDC都具备未成熟与成熟DC的典型镜下特征：未成熟的细胞呈圆球状，表面无明显突起，而加入两种促成熟因子组合的DC，则表现出成熟树突状细胞表面特有的明显的不规则突起，但肉眼不能区分两种组合对DC的促成熟能力（图1）。经0.4%台盼蓝染发显示细胞存活率均 ＞95%。

2.2 树突状细胞的表型分析

收集体外培养第8天的6组DC，经流式细胞仪检测发现，未加入促成熟因子的对照组的细胞CD80和CD83的表达量都很低（图2）；而无论是X-VIVO还是CellGro培养的DC，加入促成熟因子后，CD80和CD83的表达量明显高于对照组，使用鸡尾酒组促成熟的细胞CD80和CD83的表达均高于使用TNF-α组促成熟的细胞。X-VIVO鸡尾酒组培养的DC，CD80（88.31±1.04）% ，CD83（43.66±0.87）% ，X-VIVO TNF-α 组培养的 DC，CD80（50.74±2.45）%，CD83（27.99±1.88）%， CellGro鸡尾酒组培养的 DC，CD80（95.92±3.44）%，CD83（70.00±2.01）%，CellGro TNF-α 组培养 的 DC，CD80（77.35±1.08）%，CD83（50.42±1.80）%（图3）。

2.3 树突状细胞的细胞因子水平表达情况

六组DC分泌IL-10和IL-12p70水平，具体见表2。

3 讨论

图1 倒置显微镜下两种培养基培养的DC（×40）

图2 对照组CD80和CD83细胞表面标志表达量

表2 不同培养体系分泌细胞因子水平（±s，n=3）

表2 不同培养体系分泌细胞因子水平（±s，n=3）

注：与X-VIVO对照组比较，*P＜0.05

组别 表达水平（pg/mL）IL-10 IL-12p70 X-VIVO鸡尾酒组X-VIVO TNF-α组X-VIVO对照组CellGro鸡尾酒组CellGro TNF-α组CellGro对照组4.4±0.9 3.9±0.9 4.1±0.9 8.5±0.8 6.4±1.1 5.7±0.9 8.2±0.5*13.2±1.1*17.7±0.9 5.8±1.3 19.2±0.8 36.0±0.9

在过去的10年中，人们对DC免疫生物学及其功能调整的理解逐渐加强，导致了以DC为基础的肿瘤疫苗的发展，继而使人们不断地寻找体外培养DC的更优化条件和体系。本实验设计的两种培养基，均为无血清培养基，但由于培养基组成不同，可能具有不同的模拟体外的微环境，从而影响DC的功能和表型等特点。X-VIVO 15TM是调整优化使之适合于无血清条件下肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的增殖，其配方有助于外周血及人类肿瘤中分离纯化的CD3+细胞的增殖[3-4]。同时还用于维持人类单核细胞、巨噬细胞及细胞系、粒细胞和自然杀伤细胞（NK）的生长。而CellGro DC培养基用于单核细胞或来自于CD34+造血干细胞产生的树突状细胞的最优化生长，不含生长因子、抗生素或未确定的添加剂，含人蛋白、重组人的胰岛素和人的铁传递蛋白的完全配方。本研究结果显示，经过X-VIVO 15TM和CellGro培养基培养出的DC在细胞形态上几乎无差别，但在细胞表型和细胞因子分泌上则有很多差异。显然，在相同促成熟条件下，使用CellGro培养的DC的CD80、CD83均高于使用 X-VIVO培养的DC，差异有统计学意义（P＜0.05），即说明前者的DC成熟度高于后者，这可能说明CellGro更适合于PBMC来源的DC的体外培养。早在1997年，Jonuleit等提出，应用鸡尾酒组合促成熟的DC被人们称为“标准DC”。他们证明这项混合物可以诱导DC的成熟，并且可以完全地取代Romani等之前提出的条件培养基。后有学者[5]证明了在细胞因子组合中添加PGE2（1 μg/mL）可以进一步增强DC传代的产量、质量和迁移能力。本实验中的结果显示，在相同培养基条件下，鸡尾酒组的DC的CD80、CD83均高于TNF-α组DC，差异有统计学意义（P＜0.05），这说明，鸡尾酒组促成熟效果优于单纯使用TNF-α，与Landi等[1]得出的结论是一致的。

笔者在检测DC表型的基础上，进一步对其作用机制进行了初步的探讨。由于细胞因子在DC的分化与功能等方面都有十分重要的作用，因此，本研究使用ELISA的方法，收集各组不同培养体系的上清液，检测细胞因子分泌情况。理论上来讲，在遇到外来抗原，DC可分泌以IL-12和IFN-γ为主的细胞因子，介导Th1型免疫反应；对于自身抗原，部分其他功能的DC可通过分泌IL-10诱导调节性T细胞与Th2细胞介导免疫耐受[3]。本研究结果显示，相同培养基条件下，鸡尾酒组IL-12p70和IL-10普遍低于TNF-α组，这可能与PGE2有关，因为PGE2可增加DC的迁移能力，但是却抑制IL-12p70和IL-10的分泌[4]，这是鸡尾酒组用于DC促成熟方面的弊端，目前，有研究显示，鸡尾酒组合联合应用TLR3配体polyⅠC和TLR7/8配体R848以及PGE2促成熟的DC可兼具高迁移能力和高产量的IL-12p705，还也可以在以后的试验中设计加入TLR类配体来证实这一点。

目前DC的体外培养方法虽已基本满足基础研究的需要，但是应用于临床治疗还需要进一步研究，因此，建立一种合理的培养体系仍是今后研究的方向。

[1]LandiA，Babiuk LA，Drunen LH.Dendriticcellsmatured bya prostaglandin E2-containing cocktail can produce high levels of IL-12p70 and are more mature and Th1-biased than dendritic cells treated with TNF-alpha or LPS[J].Immunobiology，2011，216（6）：649-662.

[2]Johansson U，Walther JL，Hofmann A，et al.Dendritic cells are able to produce IL-12p70 after uptake of apoptotic cells[J].Immunobiology，2011，216（1-2）：251-255.

[3]Couper KN，Blount DG，Riley EM.IL-10：the master regulator of immunity to infection[J].J Immunol，2008，180（9）：5771-5777.

[4]Boullart AC，Aarntzen EH，Verdijk P，et al.Maturation of monocytederived dendritic cells with Toll-like receptor 3 and 7/8 ligands combined with prostaglandin E2 resultsin high interleukin-12 production and cell migration[J].Cancer Immunol Immunother，2008，57（11）：1589-1597.

[5]Gerty S，Daniel B，Danita S， et al.Commonly used prophylactic vaccines as an alternative for synthetically produced TLR ligands to mature monocyte-derived dendritic cells[J].Blood，2010，116（4）：564-574.