Kiss-1基因启动子甲基化与结直肠癌的关系

陈志华，戴起宝，陈绍勤，林素勇

(福建医科大学附属第一医院胃肠外科，福建福州350005)

结直肠癌的发生、发展是多基因参与的、多阶段多步骤的演变过程，肿瘤转移抑制基因Kiss-1与结直肠癌的发生、发展关系密切。随着结直肠癌恶性演进，Kiss-1基因表达下降，但具体原因尚不明确，可能与DNA启动子甲基化修饰参与调控抑癌基因的表达等因素有关。本研究通过检测不同组织中Kiss-1基因启动子甲基化状态，分析其与结直肠癌临床病理学特征的关系及其临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2011年4月至2011年8月福建医科大学附属第一医院胃肠外科肠镜切取的142例正常结直肠组织、23例结直肠腺瘤、手术切除的73例新鲜结直肠癌瘤体及癌旁组织标本，液氮保存。入选的结直肠癌病例术前未经化疗、放疗;平均年龄59.28岁;男性39例，女性34例;淋巴结转移30例;远处转移5例，其中肝脏转移3例，肺部转移2例。

1.2 主要试剂 DNA提取试剂盒和蛋白酶K(北京白泰克公司)，亚硫酸氢钠和对苯二酚(Sigma公司)，Wizard DNA Clean-Up System试剂盒(Promega公司)，CpG甲基化酶M.SssⅠ(New England Biolabs公司)。Kiss-1基因引物参照文献［1］设计，由上海生物技术工程有限公司合成。见表1。

表1 Kiss-1基因甲基化特异PCR引物序列

1.3 方法

1.3.1 甲基化特异性PCR 应用基因组DNA提取试剂盒提取结直肠组织基因组DNA，定量后取2 μg DNA按照甲基化特异性PCR修饰DNA，修饰后DNA用Wizard DNA Clean-Up System试剂盒纯化，并回收DNA，溶于20 μL灭菌去离子水，-20℃保存备用。反应体系25 μL，修饰后 DNA 3 μL，10 × Taq Buffer 2 μL，10 mmol·L-1dNTP 0.5 μL，25 mmol·L-1MgCl21.5 μL，引物各 1 μL，Taq 酶 0.2 μL;反应条件:95 ℃5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35 个循环，72℃ 7 min。取5 μL PCR产物加入2 μL上样缓冲液，于质量分数2%琼脂糖凝胶上电泳。

1.3.2 对照组设置 在每批PCR扩增时均设置甲基化阳性对照(CpG甲基化酶M.SssⅠ修饰后新鲜胎盘组织DNA为模板)、甲基化阴性对照(胎盘组织DNA为模板)和阴性对照(H2O为模板)。

1.3.3 结果判断 DNA样品经甲基化特异性引物(M)和非特异性引物(U)扩增，DNA markerⅠ标记，是否为特异引物扩展特异产物。M有特异产物，而U无产物，判断为纯合型甲基化阳性;如果两者都有特异产物，判断为杂合型甲基化阳性;如果U扩展出特异产物，而M无产物，判断为甲基化阴性;如果两者均无特异产物，实验失败，重做。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0进行统计分析，计数资料比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 Kiss-1基因启动子甲基化检测结果 不同组织中Kiss-1基因启动子甲基化检测结果见图1。

2.2 Kiss-1基因启动子甲基化状态的比较 结直肠癌组织中Kiss-1基因启动子甲基化阳性率为82.2%，癌旁组织为30.1%，结直肠腺瘤组织为21.7%，正常结直肠组织为6.3%，阳性率在结直肠癌、癌旁组织、结直肠腺瘤、正常结直肠组织中依次下降，总体比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 不同组织中Kiss-1基因启动子甲基化阳性率的比较

2.3 Kiss-1基因启动子甲基化状态与结直肠癌临床病理学特征的关系 Kiss-1基因启动子甲基化阳性率与结直肠癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及远处转移有关(P＜0.05)。见表3。

3 讨论

Kiss-1基因是Lee等［2］在黑色素瘤细胞株中发现的肿瘤转移抑制基因，Kiss-1基因表达产物可以抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的分化和凋亡。国内外研究［3-4］表明Kiss-1基因表达下降与恶性肿瘤的转移特性和不良预后有关，本课题组前期研究［5-6］发现Kiss-1基因表达缺失可以促进结直肠癌的转移，但Kiss-1基因表达水平改变的原因尚不明确。

表3 结直肠癌组织中Kiss-1基因启动子甲基化状态与临床病理学特征之间的关系

基因异常甲基化是导致抑癌基因失活的主要原因之一，肿瘤相关基因的启动子发生了异常甲基化，如结直肠癌组织中 MLH1、APC、MGMT、RASSF1A、P16 等基因均发现异常甲基化现象，导致基因表达下降，从而抑制其在信号转导、细胞周期调节、DNA修复、血管形成等方面发挥重要作用，促进肿瘤的发生、发展及转移［7-8］。有研究［9］发现膀胱癌组织中 Kiss-1基因启动子异常甲基化，且与膀胱癌的发生、发展密切相关，与Kiss-1基因表达下降密切相关，促进膀胱癌浸润、转移的发生。

本研究结果显示:结直肠癌组织中Kiss-1基因启动子甲基化阳性率为82.2%，癌旁组织为30.1%，结直肠腺瘤组织为21.7%，正常结直肠组织为6.3%，在结直肠癌发生的不同阶段，Kiss-1基因启动子甲基化阳性率有明显差异，提示Kiss-1基因启动子甲基化可能促进结直肠癌的发生。随着结直肠癌的分化程度降低、浸润深度进展和转移发生，Kiss-1基因启动子甲基化程度逐步增高，Kiss-1基因启动子异常甲基化有可能促进结直肠癌的恶性演进，Kiss-1基因启动子甲基化水平的检测对临床评估结直肠癌转移风险和预后可能有一定的参考价值。

DNA甲基化是一种可逆的过程，Yamashita等［1］应用5-脱氧杂氮胞苷逆转胃癌细胞珠Kiss-1基因启动子异常甲基化，发现Kiss-1基因的表达明显升高，通过逆转结直肠癌组织中Kiss-1基因启动子甲基化状态亦有可能提高Kiss-1基因的表达水平，进而降低结直肠癌转移潜能，这为预防和治疗结直肠癌转移提供了新思路。

［1］Yamashita S，Tsujino Y，Moriguchi K，et al.Chemical genomic screening for methylation-silenced genes in gastric cancer cell lines using 5-aza-2’-deoxycytidine treatment and oligonucleotide microarray［J］.Cancer Sci，2006，97(1):64-71.

［2］Lee JH，Miele ME，Hicks DJ，et al.KiSS-1，a novel human malignant melanoma metastasis-suppressor gene［J］.J Natl Cancer Inst，1996，88(23):1731-1737.

［3］Guan-Zhen Y，Ying C，Can-Rong N，et al.Reduced protein expression of metastasis-related genes(nm23，KISS1，KAI1 and p53)in lymph node and liver metastases of gastric cancer［J］.Int J Exp Pathol，2007，88(3):175-183.

［4］Prentice LM，Klausen C，Kalloger S，et al.Kisspeptin and GPR54 immunoreactivity in a cohort of 518 patients defines favourable prognosis and clear cell subtype in ovarian carcinoma［J］.BMC Med，2007，5:33.

［5］林素勇，戴起宝，陈绍勤，等.Kiss l蛋白及其受体GPR54在结直肠癌中表达的意义［J］.肿瘤研究与临床，2010，22(6):406-409.

［6］陈绍勤，林素勇，戴起宝，等.肿瘤转移抑制基因Kiss-1对构建原代人结直肠癌裸鼠肝转移瘤模型的影响［J］.中华实验外科学，2012，29:209-211.

［7］Ahlquist T，Lind GE，Costa VL，et al.Gene methylation profiles of normal mucosa，and benign and malignant colorectal tumors identify early onset markers［J］.Mol Cancer，2008，7:94.

［8］Lee BB，Lee EJ，Jung EH，et al.Aberrant methylation of APC，MGMT，RASSF2A，and Wif-1 genes in plasma as a biomarker for early detection of colorectal cancer［J］.Clin Cancer Res，2009，15(19):6185-6191.

［9］Cebrian V，Fierro M，Orenes-Piñero E，et al.KISS1 methylation and expression as tumor stratification biomarkers and clinical outcome prognosticators for bladder cancer patients［J］.Am J Pathol，2011，179(2):540-546.